γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚各組織中SOD和GSH－Px酶活性的影響

李維宏，蘇斌，肖瑞雪

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷030801）

納米材料是指幾何尺度在1～100 n m，同時(shí)具有特殊性能的材料，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、復(fù)合材料、信息技術(shù)、催化氧化、生物醫(yī)學(xué)工程和環(huán)保等領(lǐng)域，且有望開發(fā)新的用途［1～4］。環(huán)境中的納米顆粒主要來(lái)自于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)和一些在環(huán)境中天然形成的納米尺度的顆粒物［5，6］。該材料所特有的量子尺寸效應(yīng)、催化特征、小尺寸效用、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效用，使得物質(zhì)的表面特征和晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化［7～10］，與常規(guī)尺寸的物質(zhì)相比，當(dāng)納米材料進(jìn)入生物體后，它們所顯示的化學(xué)特性和生物活性會(huì)有很大不同，研究表明，一些原本無(wú)毒或者低毒的物質(zhì)當(dāng)粒徑達(dá)到納米級(jí)時(shí)毒性明顯增強(qiáng)［11］。肖琳等研究比較了納米Si O2和常規(guī)Si O2對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，二者均能對(duì)Hela細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但納米Si O2的細(xì)胞毒性強(qiáng)于常規(guī)Si O2，同時(shí)在低濃度下，納米Si O2和常規(guī)Si O2都表現(xiàn)出很好的生物相容性［10］。

近幾年有關(guān)納米材料的毒理學(xué)效應(yīng)研究主要集中在Ti O2納米顆粒、碳納米管和富勒烯等材料上［12～19］，例如，李俊剛等得出 Ti O2納米顆粒會(huì)對(duì)小鼠大腦造成血腦屏障破損、組織內(nèi)溢血和組織壞死等損傷［16］，Cui等研究了單壁碳納米管對(duì)人體HEK293細(xì)胞的作用，結(jié)果表明碳納米管通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和減少細(xì)胞的粘附力，進(jìn)而抑制HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而隨著納米技術(shù)的發(fā)展以及納米材料的多樣化（Zn O，Cd S，Al2O3，F(xiàn)e2O3），使得其他納米材料的生物安全研究尤為重要［12］。其中，具有超順磁性的Fe2O3納米粒子作為磁性載體被廣泛地應(yīng)用到醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，成為磁共振成像診斷、磁性藥物載體及腫瘤靶向定位治療中的熱門生物材料，與此同時(shí)，其對(duì)機(jī)體毒性的研究也逐漸受到重視［20～22］。李志勇等比較了三氧化二鐵納米磁流體對(duì)小鼠心肺組織的氧化損傷，結(jié)果表明該類物質(zhì)可能誘導(dǎo)了肺部網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和中性粒細(xì)胞的活化，促使呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量自由基從而造成較為嚴(yán)重的肺部損傷，而對(duì)心臟的氧化損傷比較輕微［23］。γ－Fe2O3為Fe2O3在自然界中存在的一種晶型，目前有關(guān)γ－Fe2O3納米顆粒的毒性研究很少，尤其是系統(tǒng)性地研究其對(duì)生物各個(gè)組織的毒理學(xué)效應(yīng)，因此有必要開展相關(guān)的γ－Fe2O3納米顆粒毒理學(xué)研究。

本文選取養(yǎng)殖中常見的鯉魚為實(shí)驗(yàn)魚種，以體外直接暴露方式，分析染毒前后鯉魚鰓、肝、腎、脾以及腦中SOD活力和GSH－Px含量的變化，以此來(lái)反映γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚內(nèi)在抗氧化系統(tǒng)的影響，為進(jìn)一步評(píng)估水環(huán)境中γ－Fe2O3納米顆粒的生物學(xué)負(fù)面效應(yīng)提供參考資料。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

主要試劑：γ－Fe2O3納米顆粒為棕色粉末（粒徑20 n m，純度≥99．9%），購(gòu)自北京納辰科技發(fā)展有限責(zé)任公司。SOD和GSH－Px試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

儀器：78 H W－1型恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機(jī)廠），低溫高速冷凍離心機(jī)（Ther mo公司），數(shù)控超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)用鯉魚均購(gòu)自當(dāng)?shù)鼗B魚蟲市場(chǎng)，平均體長(zhǎng)8～10 c m，平均體重15～18 g，實(shí)驗(yàn)前先在水族箱（100 L）內(nèi)馴養(yǎng)2周以上，并于實(shí)驗(yàn)前1 d停止投餌。養(yǎng)育用水為充分曝氣的自來(lái)水，水溫22～24℃，p H 值6．8～7．2。實(shí)驗(yàn)期間不間斷地充氧，水中溶氧量為5．5～6．3 mg·L－1。

γ－Fe2O3納米顆粒儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取1．00 gγ－Fe2O3納米顆粒于1 L的棕色容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，得到濃度為1 g·L－1的γ－Fe2O3納米顆粒懸濁液，4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫褂们俺暦稚?0 min。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

暴露實(shí)驗(yàn)在水族箱中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為5組：4個(gè)染毒組，其中 γ－Fe2O3濃度分別為0．1、1、10、100 mg·L－1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)不加γ－Fe2O3的空白對(duì)照組。每組放入鯉魚12尾，染毒時(shí)間為30 d，每天定時(shí)全部更換實(shí)驗(yàn)用水，重新配置γ－Fe2O3各染毒組，保證實(shí)驗(yàn)期間各組的質(zhì)量濃度一致。實(shí)驗(yàn)期間鯉魚自由飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取3尾鯉魚，迅速解剖分別取腦、腮、肝、腎、脾各組織，置于液氮中保存，待測(cè)其相應(yīng)的SOD和GSH－Px含量變化。

1．4 組織勻漿的制備

融化液氮中保存的各個(gè)鯉魚組織，隨后用生理鹽水（0．9%）漂洗掉待測(cè)組織表面的血漬，用濾紙拭干殘留在組織表面的生理鹽水，將各個(gè)組織稱重計(jì)量。按重量體積比1∶9用一定量的生理鹽水（0．9%），將各個(gè)組織配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿，所得的組織勻漿液在－4℃，2500 r·min－1下快速離心10 min，取上清液待測(cè)。

1．5 測(cè)定方法

SOD活力和GSH－Px含量的測(cè)定，分別嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行，并按照試劑盒上面的公式進(jìn)行計(jì)算。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2010軟件進(jìn)行建庫(kù)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS16．0進(jìn)行，其中組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），所得數(shù)據(jù)以p＞0．05表示差異不顯著，p＜0．05表示差異顯著，p＜0．01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2．1 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚腦組織中SOD和GSH－Px活力的影響

圖1為SEM測(cè)試結(jié)果，從圖中可以看出該γ－Fe2O3納米顆粒為球形，平均粒徑約為200 n m。鯉魚暴露在不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒懸濁液30 d后，其腦組織中SOD和GSH－Px活力變化如圖2所示。從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚腦組織SOD和GSH－Px含量均有一定的抑制作用，但影響程度略有差異，且不存在明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系。不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚腦組織SOD含量影響不大，0．1 mg·L－1處理組與對(duì)照組相比較具有顯著性差異（p＜0．05），10 mg·L－1、100 mg·L－1處理組與對(duì)照組相比較具有極顯著性的差異（p＜0．01），而1 mg· L－1處理組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（p＜0．05）。不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒均對(duì)鯉魚各個(gè)組織中的GSH－Px產(chǎn)生一定的抑制作用，且與對(duì)照組相比，均存在顯著性差異（p＜0．01、p＜0．05）。

圖1 γ－Fe2 O3納米顆粒SEM照片F(xiàn)ig．1 SEM i mage ofγ－Fe2 O3 nanoparticles

2．2 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚鰓組織中SOD和GSH－Px活力的影響

圖2 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚腦組織中SOD和GSHPx活力的影響Fig．2 Effects of various concentrations ofγ－Fe2 O3 nanoparticles on the SOD and GSH－Px activities of car ps brain

鯉魚暴露在不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒懸濁液30 d后，其鰓組織中SOD和GSH－Px活力變化如圖3所示。由圖3可以看出，與對(duì)照組相比較，不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚鰓組織中SOD含量均產(chǎn)生明顯的抑制作用。與對(duì)照組相比，SOD在不同濃度下降低的大小不同，10 mg·L－1組產(chǎn)生的抑制作用最明顯，表現(xiàn)出極顯著性差異（p＜0．01）。不同濃度的處理組GSH－Px含量均比對(duì)照組高，10 mg·L－1劑量組和100 mg·L－1劑量組與對(duì)照組比較存在顯著性差異（p＜0．05）。

圖3 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚腮組織中SOD和GSHPx活力的影響Fig．3 Effects of various concentrations ofγ－Fe2 O3 nanoparticles on the SOD and GSH－Px activities of car ps gill

2．3 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚肝組織中SOD和GSH－Px活力的影響

鯉魚暴露在不同濃度下γ－Fe2O3納米顆粒懸濁液30 d后，其肝組織勻漿中SOD和GSH－Px活力變化如圖4所示。由圖4可以看出，不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒均對(duì)鯉魚肝組織勻漿中SOD和GSH－Px活力產(chǎn)生明顯的抑制作用，除10 mg·L－1處理組外，存在明顯的劑量——效應(yīng)關(guān)系。不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚肝組織SOD活力均產(chǎn)生抑制作用，較低濃度組（0．1 mg·L－1、1 mg·L－1）與對(duì)照組相比具有極顯著性差異（p＜0．01），高濃度組（100 mg·L－1）與對(duì)照組相比具有顯著性差異（p＜0．05），同時(shí)10 mg·L－1組與對(duì)照組相比較活力降低，但不存在顯著性差異。不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚肝組織GSH－Px活力產(chǎn)生抑制作用，濃度組1 mg·L－1和100 mg·L－1與對(duì)照組存在顯著性差異（p＜0．05）。研究結(jié)果表明，γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚的肝組織可以產(chǎn)生明顯的氧化損傷作用，可以推測(cè)肝臟為γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚氧化損傷過(guò)程中的靶器官。

圖4 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚肝組織中SOD和GSHPx活力的影響Fig．4 Effects of various concentrations ofγ－Fe2 O3 nanoparticles on the SOD and GSH－Px activities of carps liver

2．4 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚脾組織中SOD和GSH－Px活力的影響

在不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒懸濁液暴露30 d后，鯉魚脾組織中SOD和GSH－Px活力變化如圖5所示。由圖5可以看出，不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚脾組織中SOD的含量產(chǎn)生明顯的抑制作用；除濃度組10 mg·L－1外，均存在顯著性差異（p＜0．01、p＜0．05）。對(duì)于 GSH－Px活力的影響，與對(duì)照組相比，0．1 mg·L－1劑量組和10 mg·L－1劑量組GSH－Px活力降低，1 mg·L－1劑量組和100 mg·L－1劑量組與對(duì)照組相比升高，且具有顯著性差異（p＜0．05，p＜0．01）。

圖5 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚脾組織中SOD和GSHPx活力的影響Fig．5 Effects of various concentrations ofγ－Fe2 O3 nanoparticles on t he SOD and GSH－Px activities of carps spleen

2．5 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚腎組織中SOD和GSH－Px活力的影響

在不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒懸濁液暴露30 d后，鯉魚腎組織中SOD和GSH－Px活力變化如圖6所示。

圖6 γ－Fe2 O3納米顆粒對(duì)鯉魚腎組織中SOD和GSHPx活力的影響Fig．6 Effects of various concentrations ofγ－Fe2 O3 nanoparticles on t he SOD and GSH－Px activities of carps kidney

由圖6可以看出，與對(duì)照組相比較，不同濃度的γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)腎臟組織中的SOD的影響不明顯，但是對(duì)GSH－Px活力均產(chǎn)生抑制作用。與對(duì)照組相比，除高濃度100 mg·L－1劑量組外，GSH－Px活力均降低，且具有顯著性差異（p＜0．05，p＜0．01）。

3 討論

SOD活性和GSH－Px含量的變化可以間接反映環(huán)境中有毒污染物質(zhì)的存在，在污染物的存在下，SOD活性和GSH－Px含量可能會(huì)發(fā)生增加或者抑制，其中誘導(dǎo)效應(yīng)（增加）可以認(rèn)為是生物體克服不良環(huán)境和防止中毒的適應(yīng)性改變，而抑制作用（降低）為生物體對(duì)環(huán)境污染非常敏感并表示可能受到進(jìn)一步損傷，因此SOD活性和GSH－Px含量可以用來(lái)作為毒性研究的生物學(xué)指標(biāo)［15，16］。在納米顆粒進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生影響的時(shí)候，納米顆粒不僅會(huì)對(duì)特定的組織產(chǎn)生影響，也可能對(duì)其他組織產(chǎn)生負(fù)面的影響，因此本文系統(tǒng)地研究了γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚各個(gè)組織中的SOD活性和GSH－Px含量的變化。本次研究結(jié)果表明，通過(guò)體外直接暴露方式，γ－Fe2O3納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入鯉魚機(jī)體［6］，從而使得鰓組織為其毒性作用的直接器官，使鯉魚鰓組織的SOD活性和GSH－Px含量降低，繼而使鰓組織產(chǎn)生氧化性損傷；而鯉魚腦組織中SOD活性和GSH－Px含量的變化與納米顆粒的濃度并不存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，這可能是由于γ－Fe2O3納米顆粒進(jìn)入血液后很可能吸附血液中的成分，進(jìn)入腦組織的劑量比較少，從而腦組織SOD活性和GSH－Px含量的變化與暴露溶液中γ－Fe2O3納米顆粒的濃度并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異［16］。

通過(guò)γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚各個(gè)組織的氧化損傷作用的對(duì)比，可以推測(cè)肝臟為γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚氧化損傷過(guò)程中的靶器官。這可能是由于肝臟是體內(nèi)最重要的解毒器官，外來(lái)異物進(jìn)入機(jī)體后都需要經(jīng)過(guò)肝臟轉(zhuǎn)化，因此其應(yīng)該是受到毒性作用最嚴(yán)重的器官，其它毒性研究結(jié)果也支持這一結(jié)論［11，24，25］。相比肝組織，γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚鰓織的影響較小，這可能是由于納米顆粒進(jìn)入肝組織的量要比鰓組織多引起的［26］。

γ－Fe2O3納米顆粒引起機(jī)體氧化損傷的可能機(jī)制為，當(dāng)γ－Fe2O3納米顆粒進(jìn)入機(jī)體后，顆粒表面的活性點(diǎn)位可以與體內(nèi)的氧分子結(jié)合，形成活性氧，體內(nèi)活性氧產(chǎn)生的速度超過(guò)了機(jī)體的清除能力，過(guò)量的活性氧與SOD和GSH－Px結(jié)合，從而使SOD和GSH－Px含量降低，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生，進(jìn)而引起機(jī)體內(nèi)的氧化損傷［16，27］。

本研究所使用的γ－Fe2O3納米顆粒粒徑很小，當(dāng)達(dá)到一定濃度以后，其在水溶液中有可能發(fā)生團(tuán)聚或者分解出其他毒性物質(zhì)，從而使其原有性質(zhì)發(fā)生改變，因此本實(shí)驗(yàn)室所觀察到的組織氧化損傷作用，有可能是γ－Fe2O3納米顆粒本身、其團(tuán)聚體和水中產(chǎn)生的其他物質(zhì)所共同引起的綜合作用，以后的相關(guān)研究應(yīng)該同時(shí)考慮水溶液中的納米材料的實(shí)際濃度［28，29］。同時(shí)該論文僅考慮了暴露于不同濃度下鯉魚各組織的氧化損傷指標(biāo)的變化情況，然而，在納米顆粒引起組織氧化損傷的同時(shí)，也可能對(duì)機(jī)體造成其他方面的損害，例如，還可能引起蛋白質(zhì)變性、免疫反應(yīng)性和炎癥、組織器官的DNA斷裂損傷等，這些都有待進(jìn)一步的系統(tǒng)研究［9］。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，鯉魚各組織對(duì)γ－Fe2O3納米顆粒的相對(duì)敏感性不同，在不同的實(shí)驗(yàn)濃度下，與對(duì)照組相比，鰓、肝和脾組織中的SOD活力降低，而腦、肝和腎組織的GSH－Px含量降低。γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚內(nèi)臟組織的抗氧化系統(tǒng)有一定程度的損害。同時(shí)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝組織中SOD和GSH－Px含量變化與γ－Fe2O3納米顆粒染毒濃度存在一定的劑量——效應(yīng)關(guān)系。這說(shuō)明肝臟為γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚氧化損傷中的靶器官。γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)水生生物的損傷機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，本研究只是初步探討了γ－Fe2O3納米顆粒對(duì)鯉魚各個(gè)組織（腦，鰓，肝，腎，脾）的SOD和GSH－Px酶活性的影響，對(duì)于納米顆粒對(duì)水生生物體健康影響的其他途徑和各途徑之間的共同作用和相互聯(lián)系以及具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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