異甘露聚糖酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

汪立平，穆昭艷，張大兵，趙 勇，冷向軍

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

異甘露聚糖酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

汪立平1，穆昭艷1，張大兵2，趙 勇1，冷向軍1

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

以pET-30（a）為表達(dá)載體，將來源于枯草芽孢桿菌K-6（Bacillus subtilis K-6）的異甘露聚糖酶基因（isoman K-6）在Escherichia coli BL21（DE3）中進(jìn)行了表達(dá)。Isoman K-6登錄號為HQ902141，基因全長為1083bp，共編碼360個氨基酸，工程菌酶活為415.9U/mL，SDS-PAGE電泳表明，工程酶ISOMAN K-6分子量約為45000u，與預(yù)期分子量相符。經(jīng)IDA HisBind樹脂柱純化的純酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該重組酶為金屬酶，Al3+和Ba2+對其有很強(qiáng)的激活作用，其最適反應(yīng)溫度為55℃、最適pH為6.0，且在pH4.5～7之間有著較好的穩(wěn)定性，以槐豆膠為底物時(shí)，Vmax和Km分別為1.3U/mL和7.3mg/mL。

異甘露聚糖酶，枯草芽孢桿菌，克隆與表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)

Abstract：Agene（isoman K-6） encoding an isomannanase of Bacillus subtilis K-6 was cloned using the plasmid vector pET-30（a） and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）.Genbank accession number of isoman K-6 was HQ902141，full length of isoman K6 was 1083bp，encoding 360 amino acid residues，activity of recombinant strain was 415.9U/mL.SDS-PAGE demonstrated the molecular mass of recombinant enzyme was 45000u.The isomannanase was purified by IDA HisBind resin column，enzymatic characteristics analysis showed that the enzyme could be activated by Al3+and Ba2+，the optimum temperature was 55℃，the optimum pH for the enzyme was 6.0 and was stable from pH4.5 to 7，The apparent Kmand Vmaxvalues for locust bean gum were 1.3U/mg and 7.3mg/mL，respectively.

Key words：isomannanase；Bacillus subtilis；cloning and eexpression；characterization

甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖、甘露寡糖。根據(jù)其作用底物不同，甘露聚糖酶可分為β-甘露聚糖酶和異甘露聚糖酶[1]，其中，β-甘露聚糖酶的作用底物為魔芋粉、槐豆膠等植物多糖，這類甘露聚糖是由不同數(shù)量的甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖分子通過β-1，4-D-甘露吡喃糖苷鍵連接而成的直鏈或支鏈聚合糖。異甘露聚糖酶的作用底物為異甘露聚糖，這類甘露聚糖主要存在于酵母等微生物的細(xì)胞壁中，為高度分支的多聚體，以α-1，6-D-甘露糖為骨架鏈，其中大部分甚至全部的殘基具有α-1，2-或-1，3-連接的含有2～5個甘露糖殘基的側(cè)鏈。由于甘露聚糖酶的降解產(chǎn)物甘露寡糖可以作為一種新型的飼料添加劑代替高密度、集約化動物養(yǎng)殖中抗生素的使用[2]，所以甘露聚糖酶已成為綠色養(yǎng)殖研究的熱點(diǎn)。甘露寡糖的制備方法主要是以甘露聚糖為原料，在酶的作用下水解而成，因此，如何提高酶活制備甘露寡糖成為甘露寡糖產(chǎn)業(yè)化有待解決的主要問題。目前，以基因工程技術(shù)進(jìn)行分子育種已被用來改良產(chǎn)甘露聚糖酶微生物菌種，不同來源的甘露聚糖酶基因已被成功克隆并獲得具有生物活性的重組酶，如來源于枯草芽孢桿菌[3]、芽孢桿菌[4]、蘇云金芽孢桿菌[5]、地衣芽孢桿菌[6]、假密環(huán)菌[7]、黑曲霉酶[8]等的甘露聚糖酶基因都被成功克隆與表達(dá)，其中馬鑫[4]等將來源于芽孢桿菌的甘露聚糖酶基因在大腸桿菌pET-28（a）表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，所得工程酶的酶活力為4572U/mg，是目前為止較高的。然而迄今為止，人們所表達(dá)的工程酶都是以植物多糖為底物的β-甘露聚糖酶，對能水解異甘露聚糖的異甘露聚糖酶的分子育種未見詳細(xì)報(bào)道。異甘露聚糖是廣泛存在于微生物細(xì)胞壁中的多糖，是制備甘露寡糖極有前景的原料，因此，本研究將對來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis-6的異甘露聚糖酶基因，在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并研究其酶學(xué)性質(zhì)，從而為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis-6進(jìn)行分子育種，構(gòu)建高產(chǎn)的異甘露聚糖酶的工程菌，最終為高效制備甘露寡糖提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Bacillus subtilis-6 本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；克隆質(zhì)粒PBS-TⅡ、大腸桿菌Escherichia coli TOP10BL21 購自天根公司；表達(dá)載體PET-30（a）本實(shí)驗(yàn)保存；BamH I、HindⅢ、T4 DNA連接酶及蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn) 購自寶生生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、X-Gal、IPTG、Taq PCR Master Mix、1kb DNA Ladder marker等DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 購自天根公司；甲叉雙丙稀酰胺、Trisbase、丙稀酰胺、考馬斯亮藍(lán)G-250等 購自上海生工公司；瓊脂粉、酵母浸膏、蛋白胨等 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母細(xì)胞壁 實(shí)驗(yàn)室自制[9]。

PCR儀 杭州博日科技有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；電熱恒溫水浴槽、超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-2000 上海尤尼柯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 異甘露聚糖酶基因的克隆

1.2.1.1 菌株來源及培養(yǎng) 枯草芽孢桿菌K-6是由實(shí)驗(yàn)室篩選并保存的能分泌異甘露聚糖酶的菌株，將其以1%的接種量接到LB培養(yǎng)基中，37℃，180r/min培養(yǎng)到對數(shù)生長期，備用。

1.2.1.2 總DNA的提取 芽孢桿菌K-6總DNA的提取參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作手冊進(jìn)行。

1.2.1.3 引物的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)Genebank中枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（在引物中引入適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R別序列）如下：（F）5-CGGGATCCATGCTTAAAAAGTTAGCAG TCTGC-3（BamHⅠ）和（R）5-GCAAGCTTTTATTCCG CGATCGGCGTC-3（HindⅢ），由上海生工公司合成。

1.2.1.4 異甘露聚糖酶基因的克隆 以提取的枯草芽孢桿菌總DNA為模板，25μL PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）體系擴(kuò)增異甘露聚糖酶基因。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，54℃退火30s，72℃延伸合成1min，共30個循環(huán)后；72℃最后延伸合成5min。同時(shí)以滅菌雙蒸水作為陰性對照。將擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的基因切膠回收，與PBS-TⅡ載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli TOP10中，獲得的陽性克隆由上海生工公司代測序。

1.2.2 異甘露聚糖酶基因在大腸肝菌中的表達(dá)

1.2.2.1 異甘露聚糖酶基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 依據(jù)pET-30（a）表達(dá)載體的特點(diǎn)，利用BamH I和HindⅢ作為插入目的基因的酶切位點(diǎn)，對提取的質(zhì)粒和pET-30（a）進(jìn)行雙酶切后回收酶切產(chǎn)物。將酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Escherichia.coli BL21（DE3）中。加入卡那霉素（Kan）篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測序表明克隆正確，得到重組表達(dá)載體pET-M。

1.2.2.2 異甘露聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組表達(dá)載體pET-M轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌宿主菌BL21（DE3）中。獲得的陽性菌以1%的接種量接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，180r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，取1mL菌液做未誘導(dǎo)對照；加終濃度為1mmol/L的IPTG（Isopropyl β-D-1-ThiogalactopYranoside）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6h，取1mL誘導(dǎo)菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液（0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液）洗兩遍后重新懸浮于10mL PBS緩沖液中，超聲波破碎菌體后離心，收集上清，沉淀用10mL PBS懸浮，上清和沉淀中分別加入等體積的1×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，取10μL上12%SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）電泳。

1.2.3 異甘露聚糖酶pET-M的純化

1.2.3.1 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 將重組菌種子液按1%接種量接入含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當(dāng)OD600約為0.6～0.8時(shí)，在以下不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白：采用不同IPTG濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；不同誘導(dǎo)時(shí)間0、1、2、3、4、5、6、7h；不同誘導(dǎo)溫度20、25、28、30、32、35、37℃進(jìn)行表達(dá)，分別收集重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測以確定最優(yōu)表達(dá)條件。

1.2.3.2 異甘露聚糖酶的純化 重組菌按照優(yōu)化后的表達(dá)條件進(jìn)行大量培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液超聲波破碎后10000r/min離心10min，收集上清液為表達(dá)蛋白粗酶液。蛋白粗酶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，將4mL過濾好的菌液中加入1mL 50%Ni-NTA His-Bind樹脂懸液中，4℃結(jié)合60min后，將混合液裝入純化柱中，除去柱下端封閉蓋子，先用緩沖液A（50mmol NaH2PO4，pH8.0，300mmol NaCl，20mmol咪唑）洗去非特異性結(jié)合蛋白，然后用緩沖液B（50mmol NaH2PO4，pH8.0，300mmol NaCl，250mmol咪唑）洗脫特異性結(jié)合蛋白，對收集的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.3.3 Bradford定量測定蛋白濃度 將純化后異甘露聚糖酶融合蛋白用Bradford比色法測定蛋白含量。使用的試劑盒由上海生工公司提供。

1.2.3.4 異甘露聚糖酶活力測定 發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液[10]。采用DNS法測定酶活力[11]，用0.1mol/L檸檬酸和0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液配制成pH6.5的底物溶液0.5g/L。取底物緩沖液0.9mL預(yù)熱至60℃，添加0.1mL的粗酶液，60℃反應(yīng)10min，加入1mL DNS試劑，然后在沸水浴中顯色5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10mL搖勻，于540nm波長處測定OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的D-甘露糖含量，計(jì)算得出甘露聚糖酶活力。甘露聚糖的定義為：底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1μmol D-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.3.5 異甘露聚糖酶底物專一性的研究 取等量的外購β-甘露聚糖酶和純化后的異甘露聚糖酶作為酶液，以槐豆膠作為底物，用上述DNS法測定酶活力；取等量的外購β-甘露聚糖酶和純化后的異甘露聚糖酶作為酶液，以實(shí)驗(yàn)室自制的酵母細(xì)胞壁作為底物，用上述DNS法測定酶解產(chǎn)物含量。

1.2.4 異甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 分別在20～90℃范圍內(nèi)，以0.5%（w/v）的底物濃度測定酶活，得到最適宜酶促反應(yīng)溫度。分別在50、60、70℃保溫0～60min，對不同時(shí)間和不同溫度的樣品測定酶活。

1.2.4.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 配制一系列的緩沖液，pH3.0～11.0，將底物溶解于不同pH的緩沖液中，配制成pH不同的0.5g/L的底物溶液，其余按酶活力測定方法測定。將酶液分別加入到不同pH的緩沖液中，在37℃下保溫2h后，對不同pH的樣品測定酶活。

1.2.4.3 金屬離子等對酶活力的影響 分別配制濃度為1mmol/L的以下金屬離子化合物，Al3+、Ba2+、Ca2+、Zn2+、K+、Mg2+、Fe3+、Ag+、Cu2+、Mn2+（陰離子均為Cl-），以不含金屬離子的酶液為參照，調(diào)節(jié)pH至6.0，在37℃下保溫2h后測酶活。

1.2.4.4 動力學(xué)分析 重組異甘露聚糖酶的米氏常數(shù)通過測定不同底物濃度[S]下的反應(yīng)速度V，可以確定酶催化的最大速度Vmax和米氏常數(shù)Km。在試管中加入0.1mL酶液，再分別加入0.9mL不同濃度（0.5～20mg/mL）的底物，使總體積為1.0mL。用DNS法分別測定反應(yīng)后的OD540。1/V為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法（Line weaver-Burk），通過橫截距和縱截距求出米氏常數(shù)Km和Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 異甘露聚糖酶基因的擴(kuò)增及序列分析

從枯草芽孢桿菌K-6總DNA中PCR擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物（圖1A）的大小約為1100bp，其條帶單一，特異性強(qiáng)，與計(jì)算出的目的基因片段大小一致。將其割膠回收與PBS-TⅡ載體連接后轉(zhuǎn)入TOP10中，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)化子送到上海生工公司進(jìn)行序列測定。

測定結(jié)果表明，該片段全長1083bp，編碼360個氨基酸。通過BioEdit軟件將目的基因序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，并預(yù)測其大小約為42000u，加上表達(dá)載體上的組氨酸序列約為45000u。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，該酶的N-端有由氨基酸殘基組成的原核表達(dá)的信號肽序列，由此可以推斷出該酶可以進(jìn)行分泌表達(dá)。重組載體測序結(jié)果已提交到GenBank，其登錄號為：HQ902141。

圖1 異甘露聚糖酶PCR擴(kuò)增（A）和雙酶切鑒定（B）Fig.1 Isomannanase by PCR amplification（A）and restriction enzymes digestion（B）

2.2 異甘露聚糖酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

將包含重組異甘露聚糖酶蛋白編碼基因的質(zhì)粒用BamH I和HindⅢ雙酶切后得到約為1083bp的DNA片段，符合預(yù)期結(jié)果。雙酶切檢驗(yàn)如下（圖1B）。將載體pET-M在菌株BL21（DE3）中分別誘導(dǎo)表達(dá)6h后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，與對照菌株大腸桿菌相比，在45000u處出現(xiàn)明顯表達(dá)帶（圖2：列4）。超聲波破碎誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，收集上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，融合蛋白得到了可溶性表達(dá)（圖2：列4、列5）。

將含重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌37℃培養(yǎng)至OD600約為0.6后，在不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，結(jié)果表明，在所有的誘導(dǎo)條件中，在32℃，IPTG終濃度為0.6mmol/L的條件下誘導(dǎo)4h為最佳誘導(dǎo)條件。

2.3 異甘露聚糖酶的純化

依據(jù)重組蛋白C末端含有6個組氨酸標(biāo)簽，采用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。經(jīng)電泳分析顯示目的蛋白表達(dá)帶清晰（分子量約為45000u），與預(yù)測目的蛋白大小一致（圖2：列8）。通過鎳柱親和層析純化后得到電泳純的酶制品，純化倍數(shù)和回收率分別為2.42和39.2（表1）。在預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)誘導(dǎo)條件下進(jìn)行發(fā)酵后純化測酶活，比酶活為543.2U/mg（表1），由其折算為發(fā)酵液中可溶性酶活為415.9U/mL，根據(jù)方法1.2.3.4測的原始菌株酶活為205.9U/mL，工程菌的酶活比原始菌株的酶活提高了2.02倍。

表1 異甘露聚糖酶純化表Table 1 Purification of isomannanase from E.coli BL21（DE3）

2.4 底物專一性的研究

槐豆膠是不同單糖分子通過β-1，4-D-糖苷鍵連接而成的，而酵母甘露聚糖是以α-1，6-D-糖苷鍵連接的聚合糖。且β-甘露聚糖酶的作用底物為槐豆膠等植物多糖，異甘露聚糖酶的作用底物為異甘露聚糖，主要是存在于酵母細(xì)胞壁中的酵母甘露聚糖。由表2得知純化后的異甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時(shí)測得的酶解產(chǎn)物含量與外購β-甘露聚糖酶的酶解產(chǎn)物含量相比，其產(chǎn)物含量較低。以酵母細(xì)胞壁為底物時(shí)，異甘露聚糖酶的酶解產(chǎn)物含量為864.6U/mL，比外購β-甘露聚糖酶的酶解產(chǎn)物含量高5.4倍，結(jié)果表明，異甘露聚糖酶的專一性偏重于酵母甘露聚糖。由于很難制備得到純的酵母甘露聚糖且酵母甘露聚糖在酵母細(xì)胞壁中是以糖蛋白的混合物形式存在，作為底物時(shí)會有沉淀不適用于分光光度計(jì)法，所以在下步的酶學(xué)性質(zhì)研究中使用槐豆膠代替酵母甘露聚糖作為底物。

表2 底物專一性的研究Table 2 The study of substrate specificity

2.5 酶學(xué)性質(zhì)的研究

經(jīng)IDA HisBind樹脂柱純化的純酶酶學(xué)性質(zhì)如圖3-A所示，重組異甘露聚糖酶的最適溫度在55℃，在40～60℃范圍內(nèi)具有相對較高的酶活力。酶的熱穩(wěn)定結(jié)果如圖3-B所示，分別在50、60和70℃保溫0～60min，對不同時(shí)間和不同溫度的樣品測定酶活。由圖3-B可知該酶在50℃保溫1h后，剩余的相對酶活力為56.8%；在60℃保溫1h后，剩余的相對酶活力為54.2%；在70℃保溫1h后，剩余的相對酶活力僅為14.6%。說明該重組異甘露聚糖酶的耐熱性和熱穩(wěn)定性一般。如圖3-C和3-D所示重組異甘露聚糖酶最適pH為6.0，將其酶活定義為最高酶活，且在pH4.5～7.5之間經(jīng)2h處理后，與最高酶活相比較仍然保存70%左右的相對酶活力，屬于偏酸性酶。由表3可以看出，重組異甘露聚糖酶是金屬酶，Al3+和Ba2+對酶活力有著較大的激活作用，當(dāng)存在1mmol/L的Al3+存在時(shí)，酶活力提高了2.6倍，Ca2+，Zn2+，K+，Mg2+，F(xiàn)e3+存在時(shí)對酶活力有著激活作用，而Ag+，Cu2+，Mn2+等離子對酶活力有抑制作用。以不同濃度槐豆膠為底物測量重組酶的反應(yīng)速度，根據(jù)圖4求出最大反應(yīng)速度Vmax=1.3U/mg，米氏常數(shù)Km=7.3mg/mL。

圖3 溫度和pH對異甘露聚糖酶的影響Fig.3 Effect of temperature and pH on the isomannanase activity

圖4 異甘露聚糖酶作用酵母細(xì)胞壁的Lineweaver-Burk圖Fig.4 Lineweaver-Burk plot of isomannanase activity against yeast cell wall

3 結(jié)論

甘露寡糖作為有益菌的增殖因子，能優(yōu)化動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境[12]，降低胃腸道疾病[13]；還能夠吸附真菌毒素[14]，減少抗生素等化學(xué)藥物的使用，是生產(chǎn)綠色動物食品一種良好的添加劑。本研究成功克隆并表達(dá)了枯草芽孢桿菌K-6中的異甘露聚糖酶基因，為構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)異甘露聚糖酶奠定了基礎(chǔ)。通過誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化得知，重組菌經(jīng)32℃，0.6mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h后甘露聚糖酶活力最高可達(dá)到415.9U/mL與原始菌株比較相對提高了2.02倍。重組異甘露聚糖酶的最適溫度為55℃，最適pH為6.0，重組酶在Al3+和Ba2+的存在下酶活及其穩(wěn)定性都有提高，從這點(diǎn)可以得出異甘露聚糖重組酶是金屬酶[15]。

美國Chem Gen公司開發(fā)的甘露聚糖酶產(chǎn)品是國際市場上應(yīng)用最廣泛的飼用酶制劑之一，也是目前世界上用于玉米-豆粕型日糧的銷售量最大的酶制劑，該酶主要用于以植物甘露聚糖為原料的甘露寡糖制備，本文制備的異甘露聚糖酶是以酵母細(xì)胞壁中異甘露聚糖為原料來制備甘露寡糖，從而為甘露寡糖的制備提供了種新途徑。本研究在測定酶活力時(shí)存在不足之處，因?yàn)闆]有制備得到相對較純的酵母甘露聚糖，所以使用槐豆膠替代酵母甘露寡糖作為底物來測定酶活力，這一方法還有待進(jìn)行改善，下一步將對制備高純度的酵母甘露聚糖進(jìn)行研究，從而為甘露寡糖的制備提供更科學(xué)可靠的理論依據(jù)。

[1]張聞，汪立平，汪之和，等.甘露糖產(chǎn)生菌F1-5的鑒定及發(fā)酵條件的研究[J].食品科學(xué)，2009，37（4）：1469-1470，1478.

表3 金屬離子對酶活的影響Table 3 Effect of metal ions on recombinant isomannanase activity

[2]楊鴻坤，陳權(quán)軍，羅永發(fā)，等.β-甘露聚糖特性抗?fàn)I養(yǎng)作用及應(yīng)用[J].飼料添加劑，200（12）：18-20.

[3]Lipke PN，Ocalle R.Cell wall architecture in yeast new structure and new challenges[J].J Bacterial，1998，180（15）：3735-3740.

[4]Naanishindo Y，Nakayama K，Tanaka A，et al.Structure of the N-linked oligosaccharides that show the complete loss of alpha-1，6-polymannose outer chain of Saccharomyces cerevisiae[J].J Biological Chemistry，1993，268：26338-26345.

[5]Ponton J， Omaetxebarria MJ， ElguezabalN， etal.Immunoreactivity of the fungal cell wall[J].Medical Mycology，2001，39：101-110.

[6]Ballon L，Cohen RE，Ballou CE.Saccharomyces cerevisiae mutants that make mannoproteins with a truncated carbohydrate outer chain[J].J Biological Chemistry，1980，255：5986-5991.

[7]Nathan S，Halina L.Carbohy rates in cell recognition[J].SciAmeri，1993（1）：74-81.

[8]Castro DP，Moraes CS，Garcia ES，et al.Azambuja Inhibitory effects of D-mannose on trypanosometidlys is induced by Serratiamarcescens[J].Experimental Parasitology，2007，115：200-204.

[9]馬相杰，汪立平，冷向軍，等.β-甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁水解條件的研究[J].食品科技，2009，34（2）：7-10.

[10]楊先芹，孫丹，楊文博，等.地衣芽孢桿菌NK-27菌株的產(chǎn)酶條件和粗酶性質(zhì)的研究[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，35（2）：117-120.

[11]Akino T，Nakamura HK.Production of β-mannosidase and β-mannanase by an alkalophilic Bacillussp[J].Appl Microbio Biotechnol，1987，26（4）：323-327.

[12]喬欣君，鄒曉庭.β-甘露聚糖酶的營養(yǎng)功能及在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料研究，2006（2）：53-55.

[13]明建華，劉波，周群蘭，等.功能性寡糖在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué)，2008（9）：490-493.

[14]周中凱，夏英.飼料用葡甘露寡聚糖的研究與開發(fā)[J].糧食與飼料工業(yè)，1999（11）：37-39.

[15]Brian SH，Neil H，Robin JJ，et al.Glucose isomerase insights into protein engineering for increased thermostability[J].Biochimicaet Biophysica Acta，2000，1543；294-335.

Cloning and expression of isomannanase gene and characterization of the enzyme

WANG Li-ping1，*，MU Zhao-yan1，ZHANG Da-bing2，ZHAO Yong1，LENG Xiang-jun1
（1.School of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.School of Life and Technology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0213-05

2011-11-18

穆昭艷（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

上海市教育委員會項(xiàng)目（07ZZ137）；上海市教育委員會重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（J50704）。