Escherichia coli K5胞外多糖硫酸酯衍生物的制備及其體外抗氧化活性研究

王 華，徐靜靜，曹 鳳，陳敬華

（江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無錫 214122）

Escherichia coli K5胞外多糖硫酸酯衍生物的制備及其體外抗氧化活性研究

王 華，徐靜靜，曹 鳳，陳敬華*

（江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無錫 214122）

對(duì)Escherichia coli K5菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液上清經(jīng)超濾、醇沉、Sevage法脫蛋白、透析凍干，再經(jīng)DEAE瓊脂糖柱、G75葡聚糖柱分離純化后得到K5多糖（K5）。以三氧化硫吡啶為硫酸酯化劑，對(duì)K5多糖N位進(jìn)行了硫酸酯化，制備了K5多糖的硫酸酯衍生物（NS-K5），二糖分析結(jié)果顯示，N位硫酸酯化率達(dá)到57%。并對(duì)硫酸酯化前后的K5多糖的抗氧化性能進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，一定濃度范圍內(nèi)，NS-K5多糖還原力較K5高，當(dāng)K5和NS-K5濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率分別達(dá)到17.7%、25.6%，對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到26.1%、45%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NS-K5的抗氧化活性要高于K5。

大腸桿菌K5，胞外多糖，硫酸酯，抗氧化活性

Abstract：Escherichia coli K5 strain was cultivated by fermentation，the supernatant was treated by ultrafiltration，exopolysaccharide（EPS） was extracted by ethanol precipitation，and then purified by Sevage method，dialysis，freeze-dried，DEAE-Sepharose and Sephadex G-75 column，finally high-purity K5 polysaccharide（K5） was obtained.N site of the K5 polysaccharide was chemically sulfated by Sulfur trioxide pyridine complex，NS-K5 polysaccharide（NS-K5） was prepared，and disaccharide analysis revealed that N-sulfation rate was up to 57%.The antioxidant capacity of K5 polysaccharideand N-sulfated K5 polysaccharide was investigated，the results showed that：within a certain concentration range，the reducing activity of NS-K5 was powerful over K5，when the concentration of K5 and NS-K5 was up to 1mg/mL，the hydroxyl radical scavenging rates were 17.7% ，25.6% ，and DPPH radical scavenging rates were 26.1% ，45% ，respectively.The result indicated that NS-K5 showed stronger antioxidant activity than K5.

Key words：Escherichia coli K5；exopolysaccharide；sulfation；antioxidation

自由基的產(chǎn)生與機(jī)體的許多疾病和功能障礙，如腫瘤、炎癥、衰老等具有非常密切的關(guān)系[1-3]，隨著醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的日趨深入發(fā)展，對(duì)自由基復(fù)雜致病機(jī)理的研究成為重要的研究課題之一[4]。作為清除自由基的重要物質(zhì)——抗氧化劑，在食品工業(yè)和醫(yī)療健康領(lǐng)域的應(yīng)用由來已久[5]。目前使用的大多為化學(xué)合成類抗氧化劑，由于其存在著安全性問題，已經(jīng)被一些國家禁用或限制使用，人們對(duì)于天然來源，低毒甚至無毒的抗氧化劑的需求不斷增加，因此研究開發(fā)天然抗氧化劑具有重要的意義。多糖具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗氧化等重要的功能[6]，近年來研究者對(duì)天然多糖的抗氧化作用開展了較多的研究[7-8]，不少研究者還對(duì)天然多糖進(jìn)行了硫酸酯化修飾，并對(duì)其抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生理活性進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)其活性與硫酸酯化后的荷電性及分子量密切相關(guān)[9-12]。其中微生物來源多糖因?yàn)榫哂幸子诜蛛x純化、產(chǎn)量高、成本低等眾多優(yōu)點(diǎn)而受到研究者越來越多的重視[13-15]，但目前國內(nèi)對(duì)于微生物來源多糖及其衍生物的抗氧化研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Escherichia coli K5菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)其胞外多糖K5進(jìn)行了N位硫酸化，制備了K5多糖的硫酸酯衍生物，并對(duì)其進(jìn)行了體外抗氧化活性研究，以期為細(xì)菌胞外多糖的改性及其食品、藥品功能化的研究開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)菌種大腸桿菌E.coli Bi 8337/41（O10：K5：H4） 購自ATCC；無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、溴化鉀、水楊酸、三氯乙酸、三氯化鐵、雙氧水等 均為國產(chǎn)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HeparanaseⅠ、Ⅱ、Ⅲ 蘇州國鏑醫(yī)藥科技有限公司；1-二甲基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗壞血酸（VC） 為色譜純，Sigma公司。

紅外光譜儀NICOLET NEXUS 470 Thermo Electron Corporation；UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FreeZone2.5L冷凍干燥機(jī) 美國Labconco有限公司；恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；日立高速微量離心機(jī)CF15RXII 日本日立儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌K5多糖的制備 將大腸桿菌K5菌液接種于10L LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為600r/min，pH7.4，37℃培養(yǎng)18h。發(fā)酵液8000r/min離心10min分離菌體和上清。發(fā)酵液上清經(jīng)分子量10ku截留的超濾儀超濾濃縮，將濃縮液無水乙醇沉淀，無水乙醇終濃度為80%，4℃靜置過夜，6000r/min離心10min，收集沉淀，去離子水復(fù)溶，采用Sevage法脫蛋白，處理12～15次，醇沉，去離子水復(fù)溶，透析凍干即為K5粗多糖。經(jīng)DEAE瓊脂糖柱、G75葡聚糖凝膠柱純化后，透析凍干即得K5多糖，純度為95%。

1.2.2 N位硫酸化K5多糖的制備[16]將K5多糖溶解于2mol/L NaOH中，60℃脫乙酰反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用6mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至中性，透析凍干即為N位脫乙酰化的K5多糖。將N位脫乙酰化的K5多糖溶于去離子水，于40℃分四次加入硫酸化試劑三氧化硫吡啶（總投料比為N位脫乙?；疜5多糖∶三氧化硫吡啶=1∶2），間隔為1h，每次加完后用4mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5，反應(yīng)36h后，調(diào)節(jié)pH至中性，透析凍干后即得N位硫酸化的K5多糖。

1.2.3 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的紅外光譜分析 取1mg干燥樣品與150mg溴化鉀混合研磨壓片后，在4000～400cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描測定。

1.2.3.2 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的二糖分析 去離子水配制濃度為20mg/mL的樣品溶液，取40μL樣品溶液，加入pH7.0乙酸鈉緩沖液140μL及酶混合液（HeparanaseⅠ、Ⅱ、Ⅲ，1∶1∶1）100μL，混勻后于25℃水浴中酶解48h。HPLC分析反應(yīng)液，記錄峰響應(yīng)值。

1.2.4 K5多糖及N位硫酸化K5多糖的抗氧化活性測定

1.2.4.1 清除羥基自由基（·OH）活性的測定[17]用去離子水將各多糖樣品配制成不同的濃度梯度，以VC為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。向1mL樣品溶液中加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL，混勻后加入6mmol/L的H2O2溶液1mL，混勻后靜置10min，最后加入6mmol/L的水楊酸溶液1mL，混勻后于37℃水浴中孵育30min，離心（3000r/min，10min），以去離子水為參比，取上清在510nm處測定吸光值。

羥基自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：E為清除率；Ao為空白對(duì)照；AX為樣品溶液的吸光值；AXo為無顯色劑時(shí)樣品溶液的吸光值。

1.2.4.2 還原能力的測定[18]用去離子水將各多糖樣品配制成不同的濃度梯度。向2.5mL磷酸鹽緩沖液中加入1mL樣品溶液，再加入2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃水浴20min，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，離心（3000r/min，10min），取上清液2.5mL，加入2.5mL去離子水及0.5mL 0.1%的FeCl3溶液。以去離子水為參比，取上清液在700nm處測定吸光值。

1.2.4.3 清除DPPH·活性的測定[19]用去離子水將各多糖樣品配制成不同的濃度梯度，以VC為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用無水乙醇配制濃度為0.04mg/mL的DPPH溶液，向2mL DPPH溶液中加入2mL樣品溶液，混勻，靜置30min，離心（3000r/min，10min），取上清液于517nm處測定吸光值。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：E（DPPH·）：樣品對(duì)DPPH·的清除率；Ao：2mL DPPH·溶液+2mL去離子水混勻測定的吸光值；Ai：2mL DPPH·溶液+2mL樣品溶液混勻測定的吸光值；Aj：2mL無水乙醇+2mL樣品溶液混勻測定的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜的分析

圖1 K5多糖及NS-K5多糖的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of K5 and NS-K5 polysaccharide

K5多糖是一種N位乙?；亩嗑厶前肪厶?，如圖1所示，K5多糖及其硫酸酯衍生物紅外圖譜表現(xiàn)出多糖化合物的特征吸收峰為3418cm-1處的吸收峰是O-H的伸縮振動(dòng)；2920cm-1處的吸收峰是C-H伸縮振動(dòng)；1630cm-1處的吸收峰是C=O伸縮振動(dòng)；1043cm-1處的吸收峰是環(huán)內(nèi)醚C-O-C振動(dòng)；硫酸酯化后的K5多糖，在1229cm-1處增加了較弱的S=O伸縮振動(dòng)吸收峰；在801cm-1處增加了較為明顯的N-O-S拉伸振動(dòng)。通過紅外光譜圖可以看出，通過以上方法成功的在K5多糖N位引入硫酸基。

2.2 二糖組成分析

K5多糖的結(jié)構(gòu)由己糖醛酸-N乙酰氨基葡萄糖的重復(fù)單元組成，而NS-K5多糖由己糖醛酸-N硫酸氨基葡萄糖及己糖醛酸-N乙酰氨基葡萄糖的單元組成，本實(shí)驗(yàn)采用特異酶解樣品多糖，能夠深入分析樣品N位硫酸化的狀況。樣品二糖分析結(jié)果如圖2和表1所示。

從表1中可以看出，K5多糖的雙糖分析結(jié)果顯示較為均一，△UA-GlcNAc雙糖含量達(dá)到98.24%。NSK5多糖的二糖分析結(jié)果顯示，△UA-GlcNAc雙糖含量僅為11.99%，硫酸酯化修飾過后的△UA-GlcNS雙糖含量達(dá)到57%。

圖2 K5多糖及NS-K5多糖的二糖分析圖譜Fig.2 Disaccharide analysis spectra of K5 and NS-K5 polysaccharide

表1 樣品中二糖組成及其含量Table 1 Disaccharide composition and content of samples

2.3 抗氧化分析

2.3.1 清除羥基自由基（·OH）活性 H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的·OH，其能被水楊酸有效的捕獲，并生成2，3-二羥基苯甲酸，該羥基化合物在510nm處有特異性吸收，假若在反應(yīng)體系中加入具有清除作用的活性物質(zhì)，便會(huì)與水楊酸競爭性捕捉·OH，從而使得有色物質(zhì)生成減少。

圖3 K5、NS-K5多糖及VC對(duì)羥基自由基的清除能力的比較Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of K5，NS-K5 polysaccharide and VC

從圖3可以看出，隨著樣品濃度的增加，K5及NSK5多糖對(duì)羥基自由基的清除能力在0.05～0.5mg/mL區(qū)間內(nèi)逐步增強(qiáng)，當(dāng)濃度大于0.5mg/mL時(shí)，清除能力隨著樣品濃度的升高逐漸呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。NS-K5多糖較K5多糖清除羥基自由基的能力強(qiáng)，較VC弱，當(dāng)濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，K5多糖及NS-K5多糖的清除能力分別達(dá)到17.7%、25.6%。

2.3.2 還原能力的測定 抗氧化劑是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而去除自由基對(duì)機(jī)體損害的一類物質(zhì)，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。多糖還原能力的大小一定程度上反映了多糖抗氧化性能的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)中，樣品吸光值越高，多糖還原能力越強(qiáng)。

圖4 K5、NS-K5多糖還原能力的比較Fig.4 Comparison of reducing power of K5 and NS-K5 polysaccharide

從圖4可以看出，隨著多糖濃度的增高，反應(yīng)后樣品溶液吸光值穩(wěn)步增高，說明還原力不斷增高，上升趨勢明顯，當(dāng)多糖濃度為1mg/mL時(shí)，K5多糖的吸光值僅為0.051；NS-K5多糖的吸光值為0.12，結(jié)果表明NS-K5多糖較K5多糖還原能力強(qiáng)。

2.3.3 清除DPPH·活性的測定 DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，該法被廣泛用于測定生物試樣的抗氧化能力，其乙醇溶液呈現(xiàn)紫紅色，在517nm處有最大吸光值?？寡趸瘎┠軌蚪o自由基提供氫原子和單電子而使其褪色，其褪色的程度與抗氧化劑的抗氧化能力成定量關(guān)系，試樣吸光度越低，樣品對(duì)DPPH自由基的清除率越高，該樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。

圖5 K5、NS-K5多糖及VC對(duì)DPPH自由基清除能力的比較Fig.5 Comparison of DPPH radical scavenging capacity of K5，NS-K5 polysaccharide and VC

從圖5可以看出，K5、NS-K5多糖及VC都對(duì)DPPH自由基呈現(xiàn)出不同程度的清除作用，隨著多糖濃度的增大，其清除作用穩(wěn)步增高，其中VC的清除作用最強(qiáng)，NS-K5多糖次之，K5多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用較弱。當(dāng)多糖濃度低于0.2mg/mL時(shí)，K5多糖對(duì)DPPH自由基的清除活性比NS-K5多糖略高，但隨著多糖濃度的增大，NS-K5多糖顯示出更強(qiáng)的清除活性，當(dāng)濃度增加到1mg/mL時(shí)，NS-K5多糖對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到45%，遠(yuǎn)高于K5多糖的清除率26.1%。上述結(jié)果表明，NS-K5多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除活性高于K5多糖。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用三氧化硫吡啶法成功制備了N位硫酸酯化的K5多糖衍生物，經(jīng)二糖分析K5多糖N位硫酸酯化程度達(dá)到57%?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，N位硫酸酯化的K5多糖衍生物在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基具有一定的清除作用，顯示出一定的還原力，對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出較好的清除活性，其抗氧化活性比同等濃度下的K5多糖高。

微生物來源多糖作為重要的大分子之一，近年來成為國際研究的熱點(diǎn)，其獨(dú)特的活性和分子特點(diǎn)在藥物食品研究開發(fā)中蘊(yùn)藏巨大潛力，對(duì)于人類健康具有重要意義。本文旨在為微生物來源多糖的研究及開發(fā)提供一定的思路和理論基礎(chǔ)。

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Preparation and antioxidant activities of a sulfated derivative of exopolysaccharide from Escherichia coli K5

WANG Hua，XU Jing-jing，CAO Feng，CHEN Jing-hua*
（School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0118-04

2012-03-01 *通訊聯(lián)系人

王華（1986-），男，碩士研究生，研究方向：多糖生物學(xué)研究。

國家自然科學(xué)基金（50873080）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃（NCET-10-0435）。