超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定紅燒老抽中六種合成色素的方法

黃曉雯

（廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東廣州510075）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定紅燒老抽中六種合成色素的方法

黃曉雯

（廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東廣州510075）

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC/MS/MS）同時(shí)測定紅燒老抽中日落黃、檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、亮藍(lán)等6種合成色素的方法。樣品用水稀釋后經(jīng)過聚酰胺粉柱子凈化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。采用0.02mol/L乙酸銨和甲醇作為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.2mL/min，在7min內(nèi)實(shí)現(xiàn)6種合成色素的良好分離。串聯(lián)質(zhì)譜條件是正離子模式電離，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。6種色素在10～1000μg/L的范圍內(nèi)線性良好。6種色素的方法最低檢出限是10μg/kg，加標(biāo)回收率在80.0%～93.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4%～6.8%之間（n=6）。本方法分析快速、定性準(zhǔn)確、檢出限低，應(yīng)用到基質(zhì)復(fù)雜的老抽類液體復(fù)合調(diào)味料的檢測中效果較佳。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/MS/MS），合成色素，紅燒老抽，液體復(fù)合調(diào)味料

Abstract：A method of determination of six synthetic colorants including sunset yellow，lemon yellow，amaranth，carmine，allura red and brilliant blue in dark soy sauce by Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry was developed.The sample diluted by water was cleaned up with solid phase extraction polyamide column，analyzed by UPLC/MS/MS.The mobile phase was 0.02mol/L ammonium acetate and methanol in gradient condition.The flow rate was 0.2mL/min.Using the best gradient condition，six synthetic colorants achieved the grate separation in 7min.The condition of tandem mass spectrometer was positive ionization，using the Multiple Reaction Monitoring mode.And all the six synthetic colorants had a good linearity in a concentration range of 10～1000μg/L.The detect limit of the method was 10μg/kg to all six synthetic colorants.The spiked recoveries of six colorants ranged from 80.0%to 93.4%，with the RSDs of 2.4%～6.8%（n=6）.This method was rapid，showed good accuracy determination，and had a low limit of detection.It showed a satisfied effect of the testing in liquid multiple seasoning like dark soy sauce which had a complex matrix.

Key words：UPLC/MS/MS；synthetic colorants；dark soy sauce；liquid multiple seasoning

食用色素是食品添加劑的一種，是使食品染色后改善其色澤、提高其價(jià)值的呈色物質(zhì)。食用色素分為天然色素和合成色素兩種。合成色素由于成本低廉、色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、著色穩(wěn)定、可任意調(diào)配而應(yīng)用廣泛。然而，合成色素大多屬于煤焦油合成的染料，長期食用對(duì)人體有害。合成色素大部分有慢性毒性或致癌性，故各國都嚴(yán)格控制其使用范圍和使用量。根據(jù)GB2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定[1]，中國允許使用的合成食用色素共有8種：莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、新紅、檸檬黃、日落黃、靛藍(lán)、亮藍(lán)。液體復(fù)合調(diào)味料中的紅燒老抽多用于燒菜上色，一些產(chǎn)品通過添加色素使菜肴色澤紅亮以增加菜肴的吸引力。而醬油中是不允許添加合成色素的，液體復(fù)合調(diào)味料只允許添加檸檬黃[1]。目前，色素常用的檢測方法有分光光度法[2]、薄層色譜法[3]、示波極譜法[4]、高效液相色譜法[5-12]。這些方法存在分析或計(jì)算過程較為復(fù)雜、樣品前處理凈化效果較差、定性定量不夠準(zhǔn)確的問題。目前針對(duì)醬油的合成色素檢測方法的報(bào)道較少。相關(guān)的研究[5，11]也是采用直接稀釋法進(jìn)行簡單的前處理，使用HPLC法進(jìn)行檢測。但由于老抽類液體調(diào)味料基質(zhì)復(fù)雜，富含顏色深的焦糖色素，前處理采用直接稀釋法會(huì)讓樣品中的雜質(zhì)污染色譜質(zhì)譜體系，影響方法的靈敏度。本文探討紅燒老抽類產(chǎn)品中合成色素的檢測方法，優(yōu)化聚酰胺粉吸附條件使基質(zhì)復(fù)雜的調(diào)味液中合成色素能獲得較好的凈化效果；利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜提高定性和定量的準(zhǔn)確性，比HPLC的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[6-7]獲得更低的檢出限，而且分析時(shí)間縮短了70%，分析效果滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

日落黃、檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液中國計(jì)量科學(xué)研究院，濃度0.5mg/mL；誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr Ehrenstorfer GmbH；甲醇、甲酸 TEDIA公司；乙酸銨 Fluka公司，色譜純；氨水 廣州化學(xué)試劑廠，分析純；實(shí)驗(yàn)用水 Millipore Q Plus處理的超純水；聚酰胺粉 200目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠。

ACQUITY UPLC Quatrro Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 配有電噴霧離子源和Masslynx 4.1工作站，美國沃特世公司；pHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCHI；Bs210s天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；砂芯玻璃層析柱20cm×2.5cm。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取誘惑紅12.5mg，用純水定容至25mL，配成質(zhì)量濃度為500μg/mL的單標(biāo)溶液。準(zhǔn)確吸取六種合成色素的500μg/mL溶液20μL（除誘惑紅是固體標(biāo)準(zhǔn)品，其余色素均為標(biāo)準(zhǔn)溶液），用純水定容到10mL，得濃度為10μg/mL一級(jí)中間液。用空白樣品提取液稀釋10μg/mL一級(jí)中間液得到1μg/mL二級(jí)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取適量二級(jí)中間液，用空白樣品提取液定容得到所需的工作液及標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3 樣品提取

稱取1.00g紅燒老抽樣品到200mL燒杯，加20mL水稀釋。用0.1mol/L HCl調(diào)至pH4，加入1g聚酰胺粉，攪拌均勻后于60℃水浴保溫約20min以充分吸附色素。同時(shí)準(zhǔn)備pH4的水與樣品一起水浴60℃加熱。然后趁熱將懸浮液和聚酰胺粉轉(zhuǎn)入玻璃層析柱中，用pH4、60℃熱水少量分次洗滌至小燒杯，洗液倒入凈化柱中，以2滴/s的速度進(jìn)行層析分離。流出液棄掉。待樣液流完后用pH4、60℃熱水洗滌柱子至流出液無色，流出液棄掉。用甲醇-甲酸溶液（體積比6∶4）洗滌聚酰胺柱至流出液無色，再用超純水洗滌柱子至流出液呈中性（大約4～5次，體積約150mL）。棄去全部流出液，并用洗耳球擠出柱子的水分。用氨水-甲醇溶液（體積比1∶9）40mL解吸色素，收集流出液至100mL梨形瓶中。減壓蒸餾至色素解吸液近干，超純水定容至10mL，經(jīng)聚四氟乙烯0.22μm濾膜過濾后進(jìn)高效液相色譜系統(tǒng)測定，外標(biāo)法定量。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱：Acquity BEH C182.1mm×50mm，流動(dòng)相：0.02mol/L乙酸銨溶液（A）和甲醇（B），流速：0.2mL/min，梯度洗脫設(shè)置如表1所示。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離，正離子模式，采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式，毛細(xì)管電壓：+3.00kV，錐孔電壓：40V，二級(jí)錐孔電壓：4V，離子源溫度：100℃，脫溶劑氣溫度：300℃，脫溶劑氣流速：700L/h，碰撞氣Ar流速：0.15mL/min。MRM條件詳細(xì)見表2。

表1 流動(dòng)相梯度Table 1 Gradient table of the mobile phase

表2 6種色素質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測離子條件Table 2 The MRM condition of six synthetic colorants

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 聚酰胺粉用量優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)使用了1、2g聚酰胺粉來比較不同量的聚酰胺粉對(duì)紅燒老抽中合成色素的吸附作用。同時(shí)，使用水配制的6種混合色素標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映處理方法的原始基質(zhì)影響情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過1g聚酰胺粉處理的樣品在串聯(lián)質(zhì)譜上的回收率比2g聚酰胺粉的回收率高（具體見表3）。同時(shí)實(shí)驗(yàn)使用HPLC法[12]對(duì)兩種用量的處理方法的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種聚酰胺粉用量處理的樣品回收率基本無差別，表明使用1g聚酰胺粉做本方法的固相萃取柱填料已經(jīng)足夠吸附所測的合成色素。但在串聯(lián)質(zhì)譜上的回收率卻表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象。筆者認(rèn)為這是不同用量的聚酰胺粉處理所得樣品含的雜質(zhì)不同導(dǎo)致的結(jié)果。由于本實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是顏色深的紅燒老抽，富含顏色較深的焦糖色素。焦糖色素對(duì)合成色素在質(zhì)譜中的電離產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)影響。過多的聚酰胺粉反而會(huì)吸附過多的焦糖色素等雜質(zhì)，增加了色素在質(zhì)譜電離中受到的離子抑制作用，從而降低了合成色素的檢測靈敏度。從表3中數(shù)據(jù)看出，使用1g聚酰胺粉處理的樣液中各種合成色素的回收率要比使用2g的高，證明了使用1g聚酰胺粉處理的樣品含的雜質(zhì)比使用2g的少，對(duì)質(zhì)譜電離的離子抑制作用也就小，檢測的靈敏度就比較高。因此本實(shí)驗(yàn)采用1g聚酰胺粉來對(duì)色素進(jìn)行吸附提純。

表3 不同聚酰胺粉含量的處理方法的合成色素回收率比較Table 3 Comparison of recovery of six synthetic colorants by different amount of polyamide powder used in analysis

2.1.2 解吸液pH的調(diào)節(jié) 有研究[6-7]表示樣品在解吸完畢后需要調(diào)節(jié)pH至中性再濃縮定容。本文利用將解吸液調(diào)節(jié)pH至中性和不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)直接減壓濃縮定容上機(jī)的兩種處理手段，并觀察其色譜行為的差異，發(fā)現(xiàn)兩者在峰形和保留時(shí)間上基本沒有區(qū)別。筆者認(rèn)為解吸液中的氨在減壓蒸餾過程中已經(jīng)被蒸餾出去，因此對(duì)樣品pH影響很少。蒸餾后用水定容的樣品pH為7.5左右，呈中性。因此本方法采取不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)直接減壓濃縮定容上機(jī)分析的方式進(jìn)行前處理，加快前處理的速度。

2.2 色譜條件的建立

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜（UPLC）進(jìn)行分析，使用1.7μm顆粒填料的BEH C18，能獲得高柱效的色譜峰，而且大大縮短了分析時(shí)間和使用的溶劑體積，分析時(shí)間從一般的12～20min[5-10]縮短到7min，在批量檢測的時(shí)候優(yōu)勢突出。

流動(dòng)相優(yōu)化：流動(dòng)相的選擇除了要考慮目標(biāo)物、雜質(zhì)的分離之外，還要考慮與質(zhì)譜的匹配情況。由于UPLC/MS/MS要求盡量使用濃度較低的鹽溶液作為流動(dòng)相，以防止鹽析堵塞管路與色譜柱，因此本方法實(shí)驗(yàn)了0.02、0.01、0.005mol/L的乙酸銨溶液與甲醇配比的體系進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸銨濃度至少要達(dá)到0.02mol/L才可以讓合成色素在正離子電離模式下帶電進(jìn)入質(zhì)譜檢測器并獲得良好的信號(hào)。通過設(shè)定梯度來實(shí)現(xiàn)對(duì)6種色素的完全分離并獲得良好的高斯峰形。6種色素的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 6種合成色素的MRM總離子流色譜圖和保留時(shí)間Fig.1 The MRM total ion chromatograms and retention time of six synthetic colorants

部分文獻(xiàn)[7，10，13]表示乙酸銨溶液需要調(diào)節(jié)至酸性來進(jìn)行分離，而另一部分文獻(xiàn)[6，8，11]則表示pH呈中性才能獲得良好的分離。筆者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.02mol/L乙酸銨溶液在不添加乙酸調(diào)節(jié)pH至酸性的時(shí)候獲得的合成色素峰形是最佳的，此時(shí)溶液的pH為6.8左右。添加酸來調(diào)節(jié)pH偏酸性反而會(huì)抑制合成色素的電離。峰高隨著pH的下降越變?cè)叫?，部分色素在pH達(dá)到3.5的時(shí)候已經(jīng)看不到有峰出現(xiàn)。合成色素以分子結(jié)構(gòu)的形式存在，難以帶電，無法電離成分子離子。因此0.02mol/L乙酸銨溶液在pH為接近中性的條件下才能使極性分子在色譜柱上獲得良好峰形的同時(shí)使分子帶電成為分子離子被質(zhì)譜所監(jiān)測到，酸性流動(dòng)相會(huì)抑制分子的電離。

2.3 質(zhì)譜條件的建立和定性確證

使用“T”形三通流路，通過蠕動(dòng)泵不斷地注入一定濃度的合成色素單體溶液。在正離子電離模式下，通過全掃描和子離子掃描優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度與流量、碰撞氣流量、碰撞室電壓等參數(shù)至分析物達(dá)到最大靈敏度。通過全掃描找出各個(gè)合成色素對(duì)應(yīng)的母離子，通過子離子掃描找出各母離子對(duì)應(yīng)的子離子，靈敏度最高的子離子作為定量離子。

6種合成色素的分子離子均為[（M-nNa）+（n+1）H]型[13]，式中M是合成色素的分子，n是分子中鈉離子的數(shù)量。如胭脂紅的分子式為C20H11N2Na3O10S3，電離后分子中三個(gè)鈉離子被三個(gè)氫離子取代，分子再加合一個(gè)氫離子帶正電形成[（M-nNa）+（n+1）H]模式的分子離子。以此分子離子作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。其子離子掃描質(zhì)譜圖見圖2。6種合成色素MRM色譜圖和保留時(shí)間見圖3。

本文的定性確證方法是利用目標(biāo)物的兩個(gè)離子對(duì)來進(jìn)行定性。離子豐度最大的1個(gè)子離子作為定量離子，離子豐度次強(qiáng)的子離子作為定性離子。利用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。利用標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的定量離子與定性離子的相對(duì)豐度比值相比較同時(shí)結(jié)合保留時(shí)間來進(jìn)行定性。

圖2 6種合成色素的子離子掃描圖Fig.2 Daughter scans spectrum of six synthetic colorants

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制、方法的線性范圍與最低檢出限

如2.1.1所述，由于紅燒老抽樣品基質(zhì)復(fù)雜，凈化后樣品仍有少量基質(zhì)效應(yīng)影響質(zhì)譜方法的靈敏度。為了校正基質(zhì)效應(yīng)帶來的儀器靈敏度降低的影響，本方法采用空白老抽樣品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品的基質(zhì)背景基本一致，從而有效消除樣品基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量準(zhǔn)確性的影響。具體配制過程見1.2。在10～1000μg/L的濃度范圍內(nèi)，6種合成色素的峰面積與質(zhì)量濃度（μg/L）呈良好的線性關(guān)系，6條曲線的相關(guān)系數(shù)r2均大于0.998。6種合成色素的線性方程見表4。

表4 6種合成色素的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear equations for determination of the six synthetic colorants by this method

根據(jù)本方法的線性范圍，10μg/L為儀器定量限濃度，對(duì)應(yīng)本方法的定量限為100μg/kg。按信噪比S/N=3計(jì)算6種色素的儀器檢出限均為1μg/L。按照本檢測方法操作，最低檢出限為10μg/kg。

2.5 精密度與回收率

平行稱取6份1g空白老抽樣品，并向樣品添加一定量的合成色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法處理測定，使用外標(biāo)法定量，并計(jì)算加標(biāo)回收率（見表5）。6種合成色素精密度和加標(biāo)回收率均滿足多組分測定的定量要求。

表5 老抽中6種合成色素精密度與加標(biāo)回收率（n=6）Table 5 Precision and recovery of six synthetic colorants in superior dark soy sauce（n=6）

3 結(jié)論

通過優(yōu)化色素前處理過程提高紅燒老抽的凈化效率和優(yōu)化超高效液相色譜分離條件來建立利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/MS/MS）對(duì)紅燒老抽中6種合成色素進(jìn)行測定的方法。方法靈敏度得到較大的提高，能獲得更低的檢出限。利用串聯(lián)質(zhì)譜定性更加準(zhǔn)確，使用的分析時(shí)間比HPLC法縮短70%。用于分析測定老抽類液體復(fù)合調(diào)味料中的合成色素在定性和定量方面都得到了滿意的結(jié)果。

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Determination of six synthetic colorants in dark soy sauce by UPLC/MS/MS

HUANG Xiao-wen
（Guangdong PRB Bio-Tech Co.，Ltd.，Guangzhou 510075，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0092-05

2011-12-20

黃曉雯（1980-），女，本科，質(zhì)量工程師，主要從事食品安全分析方面的研究。