高效液相色譜法測定北五味子有機酸含量

唐苗苗，劉翼翔，毛 婷，李蒙蒙，吳 薇，籍保平，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京100083)

高效液相色譜法測定北五味子有機酸含量

唐苗苗1，劉翼翔1，毛 婷1，李蒙蒙1，吳 薇2，*，籍保平1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京100083)

采用高效液相色譜法確定北五味子中主要有機酸，通過反相色譜法和離子排斥色譜法分離效果比較，選擇陽離子交換色譜柱作為北五味子有機酸分析柱，確定北五味子中主要有機酸為蘋果酸、檸檬酸、莽草酸，其中莽草酸在北五味子中首次發(fā)現(xiàn)。通過條件優(yōu)化，確定離子排斥色譜分離有機酸的最佳條件為，色譜柱:陽離子交換色譜柱Shimpack SCR.102H(8.0mm i.d.×300mm);流動相:0.1%磷酸水溶液;流速0.8mL/min，柱溫45℃;進樣量:10μL;檢測波長:210nm。檢測結(jié)果:北五味子鮮果中，檸檬酸含量為3.26% ±0.06%，蘋果酸為1.13% ±0.04%，莽草酸為0.53%±0.01%。

北五味子，高效液相色譜，有機酸，莽草酸

Abstract:The main organic acids of Schisandra chinensis were determinate by high performance liquid chromatography，choosing cation exchange column Shim-pack SCR.102H(8.0mm i.d.× 300mm)as analytical column of Schisandra chinensis organic acids compared with Agilent ZOBAX ×SB-C18(250mm ×4.6mm，5μm)column.Mobile phase was 0.1%H3PO4with flow rate of 0.8mL/min at 45℃.Detection wavelength was 210nm.The injection volume was 10μL.The main organic acids of Schisandra fresh fruit are malic acid，citric acid and shikimic acid which was first found in Schisandra chinensis，and the citric was(3.26 ±0.06)g/100g，malic acid was(1.13 ±0.04)g/100g，shikimic acid was(0.53 ±0.01)g/100g.

Key words:Schisandra chinensis;high-performance liquid chromatography;organic acids;shikimic acid

北五味子(Schisandra chinensis)，木蘭科五味子屬植物，落葉木質(zhì)藤本，為常用中藥，產(chǎn)于黑龍江，吉林，遼寧，內(nèi)蒙古，河北，山西，寧夏，甘肅，山東［1］。北五味子是作為藥食兩用植物，其性溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心的作用，該品既能補益心腎，又能寧心安神。在實際應用中，北五味子常用于中藥配伍中，在食品開發(fā)中也有人做過研究［2-3］，但市場上的相關(guān)產(chǎn)品較少，這主要是因為北五味子的含酸量較高，根據(jù)可滴定酸實驗檢測結(jié)果，北五味子總酸含量為4.93g/100g(以檸檬酸計)，導致其酸味過重，口感風味不佳，在產(chǎn)品研發(fā)中存在較大困難。脫酸等工藝是開發(fā)北五味子保健食品的重要手段之一，對北五味子中有機酸的組成及含量分析是研究五味子脫酸的基礎，而且，根據(jù)各有機酸的功效特性，對有機酸進行選擇性脫除有利于功能成分的最大保留。但是，在現(xiàn)有文獻報道中，關(guān)于北五味子的有機酸分析較少，已有的報道多為五味子可滴定酸的檢測［4］，而對于其具體有機酸成分及其組成情況尚不清楚。因此，本文對北五味子有機酸種類以及含量進行了分析，彌補了對北五味子有機酸研究的一個空白，而且對于北五味子功能食品的研發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北五味子 吉林長白山制藥有限責任公司;草酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、乙酸 日本和光純藥工業(yè)株式會社，超純級;乳酸 Sigma-Aldrich公司，色譜純;莽草酸 上海源葉生物科技有限公司，色譜純;甲醇 美國J.T.Baker公司，色譜純;磷酸 北京化工廠，分析純。

SHIMADZU lC-IOA型高效液相色譜儀 配有兩個泵(LC-10Avp)，柱溫箱(CTO-10Avp)和二極管陣列檢測器(PDA-10Avp)、Shim-packSCR-102H(8.0mm i.d×300mm)色譜柱，保護柱為 SCR-102HG，日本島津公司;Agilent ZOBAX×SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱 安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 隨機取50g左右-20℃冷凍的北五味子鮮果，破碎碾磨后從中準確稱取約5g置于50mL的容量瓶中，加入蒸餾水40mL，超聲波提取120min后定容至50mL。提取液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾后，稀釋5倍待測。

1.2.2 色譜柱的選擇

1.2.2.1 陽離子交換色譜柱色譜分離條件 色譜柱:陽離子交換色譜柱Shim-pack SCR.102H(8.0mm i.d.×300mm);流動相:0.1%磷酸水溶液，流速0.8mL/min，柱溫 45℃;進樣量:10μL;檢測波長:210nm;采用色譜峰保留時間定性，外標法峰高定量。

1.2.2.2 Agilent ZOBAX × SB-C18柱色譜分離條件［5］

色譜柱:Agilent ZOBAX×SB-C18(250mm×4.6mm，5μm);流動相:5%甲醇-95%pH2.5磷酸水溶液(v/v)，流速0.8mL/min，柱溫 35℃;進樣量:10μL;檢測波長:210nm;采用色譜峰保留時間定性。

1.2.3 陽離子交換色譜柱色譜分離條件的優(yōu)化

1.2.3.1 檢測波長的選擇 通過二極管陣列檢測器，對有機酸做全波長掃描(190～600nm)，選擇各有機酸響應值最高的波長作為檢測波長。

1.2.3.2 檢測溫度的選擇 根據(jù)陽離子交換色譜柱Shim-pack SCR.102H的特性及使用說明，使用溫度不宜低于40℃，以避免使用過程中柱圧過高，不利于色譜柱的保護和長期使用，因此設定檢測溫度為40、45、50℃三個溫度，觀察有機酸的分離效果。

1.2.3.3 檢測流速的選擇 設置流動相的流速為0.4、0.6、0.8、1.0mL/min，比較不同流速下的液相圖譜，確定最佳流速。

1.2.4 北五味子有機酸的檢測

1.2.4.1 北五味子有機酸種類的確定 通過離子排斥色譜保留時間對北五味子處理樣品進行有機酸定性，確定其含有有機酸種類。

1.2.4.2 標準曲線的制作以及北五味子有機酸含量的確定 用去離子水配制2000mg/L有機酸的儲備液，用去離子水稀釋至 50、100、200、250、500、100、1500、2000mg/L，作為檢測用有機酸標準溶液。

北五味子全果提取液，采用流動相稀釋5倍，0.45μm濾膜過濾，進樣量為10μL，采用外標法定量。每份樣品進行5次平行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 C18反相色譜法與離子排斥色譜法分析有機酸效果比較

反相色譜法與離子排斥色譜法的分離原理不同，分離效果不同，通過對7種有機酸的分離比較，陽離子交換色譜柱的分離效果比C18柱的效果好。如圖1所示，陽離子交換色譜柱分離色譜圖中7種有機酸分離程度較好，C18柱中7種有機酸不能完全分離，且出峰時間太短，與色譜柱的死時間接近。因此，通過分析比較，選擇陽離子交換色譜柱 Shim-pack SCR.102H作為北五味子的分析色譜柱。

2.2 離子排斥色譜法條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 檢測波長的確定 通過二極管陣列檢測器，對有機酸做全波長掃描(190～600nm)，結(jié)果顯示在210nm時有機酸的響應值最大，故選擇210nm為檢測波長。

圖1 有機酸分離色譜圖Fig.1 Chromatograms of organic acid

2.2.2 檢測溫度的選擇 通過不同溫度下有機酸分離效果比較，45℃時分離效果最佳，柱溫過度升高會縮小有機酸的分離度。

2.2.3 檢測流速的選擇 在分離檢測流速的選擇中，流速過大會使色譜柱壓力過大，陽離子交換色譜柱Shim-packSCR.102H的最大承受壓力為50kg/cm2，相比較于C18柱，需要在較低壓力下使用。設置流速過小，會增加分離中目標物的擴散作用，使得分離效果不佳，通過實驗比較，流速為0.8mL/min時分離效果好且有利于色譜柱的保護。

2.3 北五味子中有機酸的定性定量分析

2.3.1 北五味子有機酸定性分析 通過離子排斥色譜保留時間對有機酸進行定性，北五味子檢測出的有機酸的出峰時間分別與標品中的蘋果酸(8.557min)，檸檬酸(9.656min)以及莽草酸(11.151min)出峰時間一致，確定五味子鮮果中主要有機酸種類為蘋果酸，檸檬酸和莽草酸，結(jié)果如圖2所示。

2.3.2 有機酸標準曲線 取有機酸標準液，以峰高H(mV)和質(zhì)量濃度C(mg/L)求線性回歸方程。取北五味子提取液，檢測其中的有機酸含量，取同一批北五味子提取液添加一定量的各種有機酸標品溶液后測定各成分含量，每份樣品進行5次平行測定，考察方法的回收率和精密度，回收率及精密度均滿足要求，檢測結(jié)果見表1。

2.3.3 北五味子有機酸含量分析 由表1可以看出，離子排斥色譜法檢測有機酸的回收率與精密度良好，適合用于北五味子中有機酸的檢測。從表2可以看出，北五味子中主要有機酸為檸檬酸，蘋果酸以及莽草酸，其中檸檬酸和蘋果酸占北五味子總酸的90%左右，檸檬酸含量占總酸的60%以上，北五味子汁的 pH 為 2.91，檸檬酸的 pK1 為 2.87［6］，蘋果酸的pK1為3.24，北五味子的pH和檸檬酸的pK1相近，北五味子中的主要呈酸物質(zhì)為檸檬酸。根據(jù)檸檬酸，蘋果酸以及莽草酸的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，在酸脫除過程中，可以利用其極性的不同對其進行選擇性脫除。

表1 有機酸檢測回歸分析及檢出限，相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges，coefficient of determination(R2)，limit of quantification(LOQ)and limit of detection(LOD)of the organic acids

圖2 有機酸分析離子排斥色譜圖Fig.2 Chromatograms of organic acid by HPICE(High-performance ion-exclusion chromatography)

表2 北五味子中有機酸含量Table 2 Content of organic acids in Schisandra chinensis

莽草酸為莽草酸途經(jīng)的中間產(chǎn)物，它在木蘭科八角屬植物八角中含量較高，為8%～13%［7］，具有抗腫瘤的效果，對心血管系統(tǒng)也具有作用，在禽流感病毒肆虐期間，莽草酸作為合成抗擊禽流感藥物“達菲”的主要原料。北五味子為木蘭科五味子屬植物，與木蘭科八角屬親緣接近［8］，通過定性定量檢測，首次確定北五味子鮮果中含有莽草酸，莽草酸的含量為0.53%。北五味子中功能成分的研究主要集中于木脂素，五味子多糖以及五味子油等，關(guān)于莽草酸的報道較少，莽草酸具有抗腫瘤的作用，對心血管系統(tǒng)也具有作用［6］，北五味子中莽草酸的檢出及含量的測定對于其相關(guān)的功能研究具有重要的指導和參考價值。

3 結(jié)論

通過比較，離子排斥色譜法檢測北五味子中有機酸分離效果好，回收率好，精密度高，是北五味子有機酸檢測分析的較佳選擇方法。通過高效液相定性和定量檢測，確定北五味子鮮果中的主要有機酸為檸檬酸，蘋果酸以及莽草酸，檸檬酸含量為3.26%±0.06%，蘋果酸為1.13% ±0.04%，莽草酸為0.53%±0.01%。首次發(fā)現(xiàn)北五味子中莽草酸的存在，莽草酸具有抗腫瘤的效果，對心血管系統(tǒng)也具有作用，它的發(fā)現(xiàn)對于北五味子功能作用的研究提供了新思路。

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［8］劉玉壺.中國植物志［M］.北京:科學出版社，2004:232.

Determination of organic acids in Schisandra chinensis by HPLC

TANG Miao-miao1，LIU Yi-xiang1，MAO Ting1，LI Meng-meng1，WU Wei2，*，JI Bao-ping1，*
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China;(2.College of Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China)

TS207.3

A

1002-0306(2012)15-0328-03

2011-12-14 *通訊聯(lián)系人

唐苗苗(1987-)，女，碩士，研究方向:食品科學。