鎘在蝦夷扇貝的沉積及對GPx、GST的影響

孟曉林，劉梅，王寶杰，蔣克勇，田雪，王雷

（1．中國科學院 海洋研究所，山東 青島266071；2．中國科學院 研究生院，北京100049；3．山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷030801）

蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）隸屬于軟體動物門（Mollusca）瓣鰓綱（Lamellibranchiata），珍珠貝目（Pterioida），扇貝科（Pectinidae），是中國北部重要的海水養(yǎng)殖品種。到2005年，年產(chǎn)量已達到15萬噸。近些年來，由于夏季環(huán)境高溫、氣候變化以及人類活動，沿海水體相關(guān)的環(huán)境因子已經(jīng)發(fā)生了極大的變化，并且對蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損害［1］。

重金屬是對生態(tài)環(huán)境造成極大危害的污染物，具有來源廣、殘毒時間長、易蓄積、污染后不易被發(fā)現(xiàn)且難于恢復等特征，并且對無脊椎動物具有極大的毒性［2］。其中鎘（Cadmium，Cd）是目前我國渤海灣海域污染比較嚴重的重金屬［3］，因此研究其在蝦夷扇貝體組織的蓄積規(guī)律和毒性作用具有重要意義。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）是一種重要的內(nèi)源性抗氧化蛋白并且廣泛分布于耗氧的生物體組織中，它通過催化過氧化氫還原為水調(diào)節(jié)組織的抗氧化防御反應［3］。谷胱 甘 肽 硫 轉(zhuǎn) 移 酶 （Glutathione S－transferases，GSTs）是谷胱甘肽復合物解毒酶家族中的重要組成部分，它可增加異源物質(zhì)的可溶性并使其從細胞中排出［4］。由于GPx、GST在解毒和抗氧化防御中的重要作用，已有研究將其作為環(huán)境監(jiān)控生物標志物［5］，但對于在重金屬作用下機體相關(guān)酶活性的變化還存在誘導或抑制的不同研究結(jié)論［6，7］。本研究以不同濃度的Cd在亞急性毒性條件下分別脅迫蝦夷扇貝，通過對其鰓、消化腺中兩種重金屬含量及GPx、GST活性的檢測，初步研究了Cd在蝦夷扇貝體組織內(nèi)的沉積規(guī)律及對谷胱甘肽依賴性酶活性的影響，明確了GPx、GST作為蝦夷扇貝Cd污染生物標志物的可行性。

1 材料與方法

1．1 實驗扇貝的來源及養(yǎng)殖條件

成體蝦夷扇貝購自大連獐子島漁業(yè)公司。挑選健康及殼高大小為8．730±0．167cm（means±SD，n＝30）的蝦夷扇貝作為實驗用貝。將扇貝在實驗條件下養(yǎng)殖于溫度為16±1℃及鹽度為30‰的過濾海水中，所用海水來源于青島第一海水浴場。暫養(yǎng)及實驗期間以螺旋藻作為餌料進行投喂，并24h不間斷充氧，每天換水一半，實驗期所換海水以損失的Cd離子進行補充。暫養(yǎng)期為7d。

1．2 實驗設計

Cd實驗組共4組（1個對照組及3個脅迫組），每組設3個平行，每平行隨機放養(yǎng)25只實驗用貝于50×40×30cm3的塑料水族箱中。所用脅迫試劑為CdCl2·2．5H2O（購自Sigma公司），加入海水中使Cd2＋終濃度分別為0mg·L－1、0．05 mg·L－1、0．1mg·L－1、0．2mg·L－1。Cd的含量為中國漁業(yè)水質(zhì)標準的0、10、20及40倍。實驗期為14d，分別在0d、1d、3d、6d、10d、14d隨機選取3只蝦夷扇貝，并對鰓、消化腺組織采樣，凍存于－80℃冰箱供測試分析備用。

1．3 Cd含量測定

取0d、3d、6d、10d、14d的蝦夷扇貝鰓、消化腺組織，于60℃烘箱中48h烘干至恒重，取約0．5 g鰓或0．2g消化腺加入30mL大小的特氟龍管中，并加入6mL HNO3在室溫下放置1h。將溶液在100℃條件下煮沸6h至澄清，將剩余物在100℃條件下溶解于6mL 1%的HNO3溶液中。Cd含量采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP－MS，Elan 6100，美國）測定。

1．4 GPx、GST活力測定

取適量蝦夷扇貝鰓、消化腺組織，稱量后置于10倍體積的預冷緩沖液中（pH 7．5，0．01mol·L－1Tris－HCl，0．0001mol·L－1EDTA－2Na，0．01mol·L－1蔗糖），并在勻漿器上勻漿，勻漿液于4℃條件下10 000g·min－1離心10min，取上清液待測。

GPx活性測定參照Xia等［8］改進的方法進行。活力單位定義為：每毫克組織蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中GSH濃度降低1 nmol為一個酶活性單位／U·mg－1protein·min－1。

GST活力測定參照Habig等［9］的方法經(jīng)改進后進行測定。酶活力定義為：每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol的2，4二硝基苯谷胱甘肽（2，4－dinitrophenyl glutathione）定義為一個酶活力單位／U·mg－1protein·min－1。

蛋白含量測定采用BradfordG－250染色法進行［10］。所有吸光值均在Powerwave XS2（BioTek，美國）酶標儀上測定。

1．5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（means±SD）表示，所有實驗數(shù)據(jù)均與對照組進行比較，并采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD法進行檢驗。統(tǒng)計軟件采用SPSS16．0，取P＜0．05做為差異性顯著標準。

2 結(jié)果與分析

2．1 Cd在蝦夷扇貝鰓、消化腺組織的生物累積

亞急性濃度Cd脅迫實驗表明（圖1），對照組鰓、消化腺組織實驗期間Cd的含量分別為1．8～3．2μ·g－1和2．41～2．93μ·g－1。兩組織中最大Cd沉積分別出現(xiàn)在10d，0．2mg·L－1脅迫組（鰓，134．20μg·g－1）和14d，0．1mg·L－1脅迫組（消化腺，109．20μg·L－1）。與對照組相比，分別提高了52倍和36倍。鰓組織中0．1mg·L－1、0．2mg·L－1脅迫組Cd的沉積于10d均達到最大值，后開始下降，而消化腺組織中各組Cd沉積濃度均隨著脅迫濃度升高、脅迫時間的延長而增大，并且消化腺組織中Cd的累積明顯高于鰓組織中Cd的累積。

圖1 Cd在蝦夷扇貝鰓（A）、消化腺（B）組織中的生物累積Fig．1 Accumulation of cadmium （Cd）in gill（A）and digestive gland（B）of Japanese scallop．

2．2 Cd對蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GPx活力的影響

亞急性濃度Cd脅迫對蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GPx活性影響表明（圖2），兩組織中GPx活性總體隨脅迫時間的延長呈先升高后下降的趨勢。其中鰓組織在0．05mg·L－1、0．1mg·L－1、0．2 mg·L－1脅迫條件下，分別于6d、3d和1d達到最大值，0．2mg·L－1脅迫組GPx活性在14d達到顯著抑制（P＜0．05）。消化腺組織在0．2mg·L－1脅迫條件下，于1d達到最大值，在0．05mg·L－1、0．1mg·L－1脅迫條件下，于3d達到最大值。消化腺組織GPx活性顯著高于鰓組織。

圖2 Cd脅迫對蝦夷扇貝鰓（A）、消化腺（B）GSH－Px活性的影響Fig．2 The effect of Cd on GSH－Px activity in gill（A）and digestive gland（B）of M．yessoensis

2．3 Cd對蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GST活性的影響

亞急性濃度Cd脅迫對蝦夷扇貝鰓組織GST活性的影響表明（圖3A），各脅迫濃度隨脅迫時間均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，0．05mg·L－1、0．1mg·L－1、0．2mg·L－1分別于10d、6d和1d達到最大值。0．2mg·L－1脅迫組在1d后，GST活性顯著下降，6d時與對照相比出現(xiàn)顯著性抑制（P＜0．05）。

Cd脅迫對消化腺組織GST活性影響表明（圖3B），0．2mg·L－1脅迫組在脅迫1d時GST活性出現(xiàn)顯著性抑制（P＜0．05），后逐步上升。0．05 mg·L－1、0．1mg·L－1脅迫組均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，最大值均出現(xiàn)在6d。

圖3 Cd脅迫對蝦夷扇貝鰓（A）、消化腺（B）GST活性的影響Fig．3 The effect of Cd on GST activity in gill（A）and digestive gland（B）of M．yessoensis

3 討論

蝦夷扇貝對不同重金屬在不同組織間的累積存在較大的差異性［11］，本研究結(jié)果表明，隨著脅迫濃度的增加，Cd在鰓及消化腺組織中的累積均出現(xiàn)了極顯著的上升，呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系。此外發(fā)現(xiàn)，鰓組織中0．1mg·L－1、0．2mg·L－1組Cd的含量在10天后下降，說明在前10天的脅迫時間內(nèi)，細胞內(nèi)金屬綁定配體持續(xù)性的與金屬離子結(jié)合，Cd離子穿過細胞膜而在組織細胞內(nèi)沉積下來，但10d后由于胞內(nèi)金屬綁定配體綁定位點的飽和，金屬離子不在結(jié)合，而出現(xiàn)下降。但消化腺組織在整個14天實驗期內(nèi)Cd離子含量均隨著時間的延長而增加，這可能與消化腺組織是主要的解毒器官，對金屬離子的耐受力更強有關(guān)。這與Choi研究結(jié)果一致［12］。

抗氧化防御體系是機體受到異源物質(zhì)脅迫時重要的代謝調(diào)節(jié)機制，其中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）通過消除H2O2來減少機體損傷。前人研究表明當雙殼貝類受到低濃度重金屬脅迫或短時間脅迫的條件下，抗氧化酶均出現(xiàn)上升，但隨著濃度的上升、脅迫時間的延長，酶活性可能會出現(xiàn)降低甚至抑制［13］。這與本研究結(jié)果相一致。Wang等對蛤的研究顯示，不同濃度Cd脅迫下，鰓及消化腺GPx活性在脅迫24h時均出現(xiàn)最大值，而本研究結(jié)果顯示，高濃度（0．2mg·L－1）脅迫條件下，GPx活性均在24h出現(xiàn)高峰，而中低濃度脅迫下（0．05mg·L－1、0．1mg·L－1），GPx活性最大值則出現(xiàn)在3d或6d。這可能和物種不同對Cd的耐受力不同有關(guān)。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于穿越細胞膜，分解后排出體外，從而達到解毒的目的，保護DNA及一些蛋白質(zhì)免受損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，中低濃度Cd（0．05mg·L－1、0．1mg·L－1）脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，GST活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，這與 Wang［15］對蛤仔（Ruditapes philippinarum）研究的結(jié)果相一致。但在高濃度（0．2mg·L－1）脅迫條件下，鰓中GST在24小時達到最大值后迅速降低，消化腺中GST則出現(xiàn)顯著性抑制。這可能與在高濃度下短時間內(nèi)蝦夷扇貝鰓及消化腺細胞受到嚴重損傷相關(guān)。此外，研究結(jié)果表明消化腺中GPx、GST活性均高于鰓組織，進一步驗證了消化腺是蝦夷扇貝的主要解毒器官，而鰓是主要的濾過性器官。

生物標志物（biomarkers）常被用來偵測和診斷毒性物質(zhì)對海洋生物的影響，對其在分子和細胞水平的檢測被推薦用作生物影響評估的早期監(jiān)測工具［16］。本研究顯示蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GPx、GST活性在不同濃度的Cd脅迫條件下均顯現(xiàn)出了敏感、顯著的變化，據(jù)此我們推斷GPx、GST可作為蝦夷扇貝養(yǎng)殖過程中受到Cd污染時的早期環(huán)境生物監(jiān)測的敏感生物標志物。

［1］Liu W，He C，Li W，et al．Discovery of host defence genes in the Japanese scallop Mizuhopecten yessoensis Jay by expressed sequence tag analysis of kidney tissue［J］．Aquac Res，2010，41：1602－1613．

［2］Viarengo A，Heavy metals in marine invertebrates：mechanisms of regulation and toxicity at the cellular level．Rev［J］．Aquat Sci，1989，1（2）：295－317．

［3］彭士濤，胡焱弟，白志鵬．渤海灣底質(zhì)重金屬污染及其潛在生態(tài)風險評價［J］．水道港口，2009，30（1）：57－60．

［4］Salazar－Medina A，Garcia－Rico L，Garacia－Orozco K，et al，Inhibition by Cu2＋and Cd2＋of a mu－class glutathione S－transferase from shrimp Litopenaeus vannamei［J］．J Biochem Mol Toxic，2010，24（4）：218－222．

［5］Cunha I，Mangas－Ramirez E，Guilhermino L．Effects of copper and cadmium on cholinesterase and glutathione S－transferase activities of two marine gastropods（Monodonta lineata and Nucella lapillus）［J］．Comp Biochem Phys C，2007，145（4）：648－657．

［6］Canesi L，Viarengo A，Leonzio C，et al．Heavy metals and glutathione metabolism in mussel tissues［J］．Aquat Toxicol，1999，46（1）：67－76．

［7］Moreira S，Guilhermino L．The use of Mytilus galloprovincialis acetylcholinesterase and glutathione S－transferases activities as biomarkers of environmental contamination along the northwest Portuguese coast［J］．Environ Monit Assess，2005，105（1）：309－325．

［8］Xia Y，Zhu L．Measurement method of glutathione peroxidase activity in blood and tissue［J］．Hygi Res，1987，16（4）：29－33．

［9］Habig，W H，M J Pabst，W B Jakoby．Glutathione S－transferases［J］．J Biol Chem，1974．249（22）：7130．

［10］Bradford M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］．Anal Biochem，1976，72：248－254．

［11］王軍，翟毓秀，寧勁松，等．養(yǎng)殖蝦夷扇貝不同組織中重金屬含量的分布［J］．海洋科學，2009，33（8）：44－47．

［12］Choi H J，Ji J，Chung K H，et al．Cadmium bioaccumulation and detoxification in the gill and digestive gland of the Antarctic bivalve Laternula elliptica［J］．Comp Biochem Phys C，2007，145（2）：227－235．

［13］Wang X，Yang H，Liu G，et al．Enzyme responses and lipid peroxidation in gills and hepatopancreas of clam Mactra vereformis，following cadmium exposure［J］．Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，29（5）：981－989．

［14］馬森．谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶研究進展［J］．動物醫(yī)學進展，2008，29（10）：53－56．

［15］Wang L，Pan L，Liu N，et al．Biomarkers and bioaccumulation of clam Ruditapes philippinarum in response to combined cadmium and benzo［α］pyrene exposure［J］．Food Chem Toxicol，2011，49（12）：3407－3417．

［16］Cajaraville M P，Bebianno M J，Blasco J，et al．The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian Peninsula：apractical approach［J］．The Science of The Total Environment，2000，247：295－311．