磷脂脂質(zhì)體對(duì)三種天然黃酮化合物穩(wěn)定作用

龔雙梅，趙良容，張榮榮，李曉波，楊昌英

天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室三峽大學(xué)，宜昌 443002

天然黃酮類化合物生理活性豐富并且廣泛存在于自然界，其抗氧化作用的研究已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視，其體外抗氧化作用主要包括直接清除超氧陰離子、羥自由基、脂質(zhì)過氧化自由基等活性氧自由基、螯合金屬離子，抑制 LDL及DNA氧化損傷。但因其穩(wěn)定性差、溶解性差、生物利用度不高，并存在一定毒性等缺點(diǎn)而限制了它們的臨床應(yīng)用。近年來，包封黃酮的脂質(zhì)體藥物的研究不斷涌現(xiàn)［1-3］，其目的包括:利用脂質(zhì)體的雙層組裝結(jié)構(gòu)增加藥物穩(wěn)定性，減緩其本身的氧化失活過程;利用脂質(zhì)體的生物相容性好，具有靶向給藥的功能，提高藥物的溶解性和生物利用度，減少藥物毒性。

除此之外，抗脂質(zhì)過氧化是黃酮化合物的重要活性之一，黃酮與脂質(zhì)雙層膜結(jié)合，可以阻止氧化性成分對(duì)生物膜的攻擊，同時(shí)可以螯合易引發(fā)脂質(zhì)過氧化的金屬離子，從而達(dá)到保護(hù)生物膜，抑制脂質(zhì)過氧化的目的。本文以木犀草素，槲皮素和山奈酚三種母體結(jié)構(gòu)相同的黃酮類化合物為研究對(duì)象(結(jié)構(gòu)如下圖)，以超聲法制備卵磷脂脂質(zhì)體，采用生物膜探針1-苯胺基-8-萘磺酸銨(ANS)研究化合物與脂質(zhì)體相互作用性質(zhì)［4，5］的基礎(chǔ)上，通過在脂質(zhì)體環(huán)境中化合物的酸離解能力及與鋁離子螯合能力的評(píng)價(jià)，探討化合物與脂質(zhì)雙層的親和性質(zhì)，及脂質(zhì)體穩(wěn)定化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的分子機(jī)制。

圖1 三種黃酮的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of three flavonoids

1 儀器與方法

1.1 儀器及試劑

UV-3010紫外可見分光光度計(jì)(日本日立公司);F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司);槲皮素 (Quercetin，Que)，山奈酚 (Kaempferol，kae)，木犀草素(Luteolin，Lut)，購(gòu)于南京TCM中藥研究所，98%(HPLC)，實(shí)驗(yàn)前以無水乙醇/水(7/3)配制成濃度為2×10-3mol/L儲(chǔ)備液;8-苯胺基-1-萘磺酸銨(8-anilinonaphthalene-1-sulphonic acid ammonium salt，ANS)，購(gòu)自 Fluka 公司，純度≧ 97%，配制 0.05 mol/L的水溶液，避光保存。卵磷脂(EPC)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品，常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次亞沸水。實(shí)驗(yàn)前配置pH=7.24的Tris-HCl緩沖液備用。

1.2 脂質(zhì)體的制備

稱取50 mg卵磷脂，溶解于5 mL有機(jī)溶劑(氯仿/甲醇:9/1)中，于30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，通N210 min除去殘留溶劑。然后加入50 mL Tris-HCl緩沖液，在N2保護(hù)下40℃溫浴10 min，在旋渦混合器上混勻1 min。保持低溫，繼續(xù)在N2保護(hù)下間斷性的超聲5 min(加冰塊0℃)，直到體系均勻分散。在2～4℃以3000 rpm的速度低溫離心20 min，取上層清液。得到半透明的10 mg/mL的EPC脂質(zhì)體，于4℃ N2氛圍下貯存，三天內(nèi)使用［6］。

1.3 光譜測(cè)定

1.3.1 ANS與載藥脂質(zhì)體相互作用的熒光光譜

在含有5%(v%)脂質(zhì)體的雙蒸水中，加入ANS儲(chǔ)備液至濃度為1.0×10-4mol/L，用熒光分光光度計(jì)記錄ANS在脂質(zhì)體中的熒光光譜，熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)條件:360 nm處激發(fā)，掃描速度:2400 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，記錄370～650 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。然后依次加入10 uL 2.0×10-3mol/L的黃酮，混合均勻，5 min后掃描熒光光譜。

在含有5%(v%)脂質(zhì)體，2.0×10-5mol/L黃酮化合物的雙蒸水中，依次加入4 uL 0.05 mol/L的ANS，混合均勻，掃描熒光。

1.3.2 黃酮化合物酸解離常數(shù)pKa的紫外-可見吸收光譜法測(cè)定

在含有5%(v%)脂質(zhì)體，2.0×10-5mol/L黃酮化合物的水溶液中，采用H2SO4，NaOH調(diào)節(jié)溶液酸堿度，采用紫外-可見分光光度計(jì)在200～500 nm范圍測(cè)定化合物的吸收光譜，同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定溶液pH值。同時(shí)測(cè)定沒有脂質(zhì)體存在時(shí)的化合物吸收譜及pH值。

1.3.3 Al3+與載藥脂質(zhì)體相互作用的紫外-可見光譜響應(yīng)

圖2 木犀草素對(duì)5%脂質(zhì)體中的ANS熒光光譜的影響;(B)三種黃酮引起的ANS熒光猝滅的劑量關(guān)系。Fig.2 The effect of Luteoin on the fluorescence spectra of ANS in presence of 5%liposomes.The concentration of flavonoids corresponding to 0-10:0-10，0 × 10-5mol/L，λex=340 nm.ANS at a concentration 1.0 × 10-4 mol/L.(B)Dose-dependent effects of three flavoniods on fluorescence of 1.0 ×10-4mol/L ANS in presence of 5%liposomes.

將含有5%(v%)脂質(zhì)體，2×10-5mol/L黃酮化合物的體系超聲1 min，靜置，逐次加入2 uL 0.01 mol/L硝酸鋁溶液，混合均勻，5 min后以水做參比，波長(zhǎng)范圍220～500 nm，掃描吸收光譜。對(duì)照組試驗(yàn)不含脂質(zhì)體。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮化合物對(duì)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的影響

ANS在水溶液中的熒光很弱，與脂膜結(jié)合后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)［7］，因此用于標(biāo)記細(xì)胞膜。由于ANS定位于脂質(zhì)雙層與水的交界面上，即親水和疏水相的界面，在疏水區(qū)有強(qiáng)烈的熒光而在水中猝滅.它不與膜的特定區(qū)域結(jié)合，外源物質(zhì)(如藥物小分子)的存在可能會(huì)影響 ANS與脂雙層的結(jié)合，從而可以間接考察藥物與脂雙層的相互作用或藥物對(duì)脂雙層結(jié)構(gòu)帶來的影響［8］，即脂雙層中磷脂分子的極性基端運(yùn)動(dòng)的程度［9，10］。如圖1A，在脂質(zhì)體環(huán)境中(5%)，ANS在530 nm左右有強(qiáng)熒光峰，木犀草素的加入使ANS熒光強(qiáng)度降低并不伴隨發(fā)射峰位的紅移，說明熒光強(qiáng)度的降低不是由于ANS分子極性環(huán)境的改變引起的，而是由于它所結(jié)合的膜脂環(huán)境的粘滯性變化，即流動(dòng)性增加引起的［4］。

表1 化合物對(duì)脂質(zhì)體中ANS的表觀熒光猝滅常數(shù)Table 1 of flavonoids for ANS fluorescence in liposomes

表1 化合物對(duì)脂質(zhì)體中ANS的表觀熒光猝滅常數(shù)Table 1 of flavonoids for ANS fluorescence in liposomes

Drug Luteolin Kempferol Quercetin Kqapp(104L/mol)3.4119 0.7543 0.7209

Stern-Volmer方程I0/I=1+KSV［Q］廣泛適用于熒光猝滅現(xiàn)象，但是當(dāng)猝滅劑分布于膜相和水相之間時(shí)，僅處于膜上的猝滅劑分子［Q］m才可以猝滅膜相中ANS的熒光，所以通過藥物總濃度得到的猝滅常數(shù)應(yīng)為表觀猝滅常數(shù)［11］。在低濃度進(jìn)行線性擬合，得到三種化合物對(duì)ANS熒光的表觀猝滅常數(shù)，列于表1。表觀猝滅常數(shù)與藥物在兩相中的分配系數(shù)密切相關(guān)。三種化合物中，熒光猝滅常數(shù)木犀草素明顯最大，其次是山奈酚，最小的是槲皮素。表明木犀草素在脂質(zhì)雙層中的分配系數(shù)大，與脂雙層的親和性好，木犀草素在水中的溶解度低，容易進(jìn)入疏水性的脂雙層，從而明顯增加膜的流動(dòng)性。細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，膜不飽和脂肪酸減少，膜脂的流動(dòng)性降低，預(yù)測(cè)木犀草素能明顯抑制脂質(zhì)過氧化過程。

圖3 脂質(zhì)體中5×10-5mol/L黃酮的存在對(duì)ANS熒光強(qiáng)度劑量關(guān)系的影響Fig.3 Dose-dependent effects of ANS in liposomes containing 5 ×10-5mol/L flavonoids.

為了進(jìn)一步考察黃酮與脂質(zhì)體的結(jié)合性質(zhì)，將黃酮(5×10-5mol/L)與脂質(zhì)體(5%)結(jié)合后，檢測(cè)探針ANS的熒光強(qiáng)度劑量關(guān)系，如圖3，在脂質(zhì)體環(huán)境中，ANS的熒光強(qiáng)度與其濃度基本呈線性關(guān)系，而脂質(zhì)體中黃酮的存在會(huì)使ANS的熒光強(qiáng)度受到影響，但槲皮素和山奈酚的影響并不明顯，只在ANS高濃度范圍產(chǎn)生一定影響，而木犀草素的存在會(huì)明顯降低ANS的發(fā)光強(qiáng)度。由于木犀草素的結(jié)合導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)改變，流動(dòng)性增加，疏水性降低，ANS的發(fā)光受到抑制，不再滿足線性的劑量關(guān)系。

因此，三種化合物可以不同程度地進(jìn)入脂雙層結(jié)構(gòu)，已經(jīng)有文獻(xiàn)證明，槲皮素結(jié)合在脂質(zhì)膜的極性頭部，并不能進(jìn)入脂雙層內(nèi)部［12］，因此對(duì)膜結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。木犀草素能進(jìn)入脂質(zhì)雙層與水的交界面，參與脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的重新組裝，處于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的包圍之中，預(yù)示脂質(zhì)膜能起到對(duì)木犀草素結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。

2.2 黃酮化合物在脂質(zhì)體中的質(zhì)子解離常數(shù)pKa

酸質(zhì)子解離常數(shù)pKa是藥物的重要理化參數(shù)。由于黃酮化合物在不同pH的緩沖液中紫外吸收光譜存在較大差異，因此，可以利用分光光度法測(cè)定其解離常數(shù)。隨著環(huán)境pH不同，黃酮化合物的紫外吸收光譜中出現(xiàn)成對(duì)的質(zhì)子化峰和去質(zhì)子化峰，隨著堿性增強(qiáng)，質(zhì)子化峰逐漸下降，去質(zhì)子化峰的峰值逐漸升高，表明黃酮化合物的酚羥基上的質(zhì)子解離。如圖4A，木犀草素水溶液隨著pH增大，345 nm的最大吸收峰發(fā)生紅移，峰值先減小后增大，化合物本身的特征峰消失，在395 nm處形成了一個(gè)新的穩(wěn)定的吸收帶，形成明顯的等色點(diǎn)。將化合物兩個(gè)波長(zhǎng)處對(duì)應(yīng)的吸收值分別對(duì)pH值作圖，得到兩條S型曲線，交叉點(diǎn)即對(duì)應(yīng)于等色點(diǎn)，此時(shí)化合物的中性形態(tài)及去質(zhì)子化態(tài)處于平衡，此時(shí)的pH可近似作為化合物的 pKa［13，14］。

圖4 稀堿(NaOH)對(duì)木犀草素的紫外可見光譜的影響;(B)脂質(zhì)體中木犀草素在345，395 nm處的吸光度隨溶液pH變化曲線(內(nèi)插圖為化合物在水中的情況)Fig.4 UV-Vis spectra of 2 ×10-5mol/L luteolin in water with varying concentration(1.0 ×10-5to 2.1 ×10-4mol/L)of NaOH;(B)Curves of absorbance at 345nm/395nm of luteolin vs pH in the presence of 5%(V%)EPC liposomes.Inset:Curves in water without liposomes.

在含5%脂質(zhì)體中，木犀草素的吸收峰隨著體系pH值變化的規(guī)律是一致的，但出現(xiàn)等色點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH明顯不同，脂質(zhì)體本身吸光度值小，對(duì)黃酮化合物的紫外吸收光譜沒有干擾。圖4B是木犀草素在脂質(zhì)體環(huán)境中兩個(gè)波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸收度與pH的關(guān)系曲線，在水中的情況以內(nèi)插圖顯示，可見，在5%的脂質(zhì)體中，木犀草素的345 nm的吸收峰隨著pH變化幅度較小，但395 nm處的吸收峰增大較快，形成的等色點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH明顯比在水中大。脂質(zhì)體中木犀草素 pKa明顯增大，為8.06(水中 pKa=7.04)。表明在脂質(zhì)體環(huán)境中，木犀草素由于與脂質(zhì)結(jié)合，進(jìn)入脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，化合物的酚羥基質(zhì)子離域能力減弱，去質(zhì)子化變得困難。用同樣方法測(cè)得槲皮素和山奈酚的pKa，結(jié)果列于表2，兩者在脂質(zhì)體環(huán)境中的pKa與水中相比分別降低了0.29，0.32。因此，在脂質(zhì)環(huán)境中，槲皮素雖結(jié)合于脂雙層的極性頭部，不能完全進(jìn)入脂質(zhì)環(huán)境，但與游離態(tài)相比，結(jié)構(gòu)仍然受到限制，在一定程度上影響了化合物的去質(zhì)子化能力。相比之下，脂質(zhì)雙層對(duì)木犀草素的穩(wěn)定和保護(hù)作用更明顯，在中性條件下，化合物難于去質(zhì)子化。黃酮含有多個(gè)酚羥基，可以提供活潑的H而發(fā)生自氧化過程，導(dǎo)致化合物不穩(wěn)定［15］。將化合物包埋于脂質(zhì)體中，可以起到穩(wěn)定化合物，防止自氧化的目的。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，三種化合物雖然母體結(jié)構(gòu)完全相同，但脂質(zhì)體對(duì)化合物的穩(wěn)定作用也存在明顯差異，木犀草素與脂質(zhì)體作用親和性好，能進(jìn)入脂質(zhì)雙層，明顯提高化合物穩(wěn)定性，而槲皮素和山奈酚與脂質(zhì)體作用較弱，不能完全包埋于脂質(zhì)雙層，只能在一定程度上起到穩(wěn)定作用。

表2 化合物在脂質(zhì)體中pKa變化值Table 2 Comparison of pKa of flavonoids in liposomes with that in water

2.3 三種黃酮化合物在脂質(zhì)體中與Al3+的螯合作用

天然黃酮由于含有多個(gè)酚羥基，易與金屬離子螯合，一方面通過螯合作用達(dá)到抑制由Fe2+，Cu2+等引發(fā)的脂質(zhì)過氧化;另外，黃酮與有些金屬離子的螯合物可以發(fā)揮更明顯的生物活性。近年來，Al3+被認(rèn)為是一種具有明顯神經(jīng)毒性的物質(zhì)，易引起老年癡呆，其機(jī)制主要與鋁促脂質(zhì)過氧化有關(guān)。本文考察在脂質(zhì)體環(huán)境中的黃酮與鋁的螯合性質(zhì)，一方面探討脂質(zhì)體對(duì)化合物螯合能力的影響，同時(shí)實(shí)驗(yàn)化合物在脂質(zhì)環(huán)境中捕獲Al3+的能力。

圖5 A，B分別是在含有2.0×10-5mol/L木犀草素的水溶液中及載有相同濃度的木犀草素的脂質(zhì)體(5%)中依次加入Al3+，記錄的紫外吸收光譜。木犀草素與Al3+螯合能力強(qiáng)，較低濃度的Al3+能很快與化合物螯合。木犀草素由自身的特征吸收峰(345 nm)到形成穩(wěn)定的螯合峰(400 nm)，形成等色點(diǎn)，在水中紫外吸收光譜隨Al3+的加入變化明顯，而在脂質(zhì)體中圖譜變化十分緩慢。說明脂質(zhì)體對(duì)黃酮化合物與Al3+螯合具有減緩、阻礙作用，即黃酮化合物的質(zhì)子轉(zhuǎn)移變得困難，使得Al3+與黃酮化合物的螯合變得困難。

圖5 Al3+加入對(duì)水溶液(A)，脂質(zhì)體(B)中木犀草素紫外可見光譜的影響Fig.5 UV-Vis spectra of 2.0 ×10-5mol/L luteolin in the presence of Al3+of varying concentration(1.0 ×10-5mol/L to1.3 ×10-4mol/L)in water(A)，and in 5%liposomes(B).C(Al3+)=1.0-8.0 ×10-5mol/L.

圖6 化合物(螯合物)的吸光度隨Al3+濃度變化曲線Fig.6 Curves of absorbances of flavonoids(flavonoid-Al complexes)vs concentration of Al3+in water or in liposomes.

對(duì)另外兩種化合物的實(shí)驗(yàn)可得出類似的結(jié)論，將三種化合物與螯合引起的兩組吸收峰的吸光度對(duì)應(yīng)于Al3+濃度做曲線擬合，得到圖6，可以看出，在脂質(zhì)體環(huán)境中，化合物的游離態(tài)與鋁復(fù)合物達(dá)到平衡時(shí)所需要的Al3+濃度明顯高于水環(huán)境。水中的木犀草素，只需要2.6×10-5mol/L的Al3+即可達(dá)到平衡，而包裹在脂質(zhì)體中的木犀草素則需要6.0×10-5mol/L的Al3+，這種現(xiàn)象可能是由于黃酮化合物包裹在脂質(zhì)體中與膜相互作用，改變了脂質(zhì)體膜的物理性質(zhì)［16］，降低了Al3+進(jìn)入脂質(zhì)體的幾率，木犀草素主要與進(jìn)入脂質(zhì)體中的Al3+結(jié)合，因此需要更高濃度的Al3+，同時(shí)，脂質(zhì)體環(huán)境中的木犀草素酚羥基活性降低，也是螯合能力下降的重要原因。

三種化合物與脂質(zhì)體的作用強(qiáng)度差異較大，但在脂質(zhì)環(huán)境中螯合Al3+的能力并未表現(xiàn)出明顯差異，推測(cè)原因是三種化合物進(jìn)入脂質(zhì)體系的程度不同，膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異，Al3+進(jìn)入膜體系的幾率會(huì)不同。木犀草素雖然在脂質(zhì)內(nèi)部，但膜的流動(dòng)性增加會(huì)導(dǎo)致Al3+進(jìn)入膜體系的幾率降低，能與其螯合的程度也會(huì)減少。槲皮素和山奈酚的水溶性較好，只能結(jié)合于脂質(zhì)外層的極性頭部，與水環(huán)境中的Al3+螯合，因此也保持著較強(qiáng)的螯合能力。因此三種化合物都能明顯抑制由Al3+引發(fā)的脂質(zhì)過氧化。

3 結(jié)論

三種黃酮化合物槲皮素，山奈酚及木犀草素雖然母體結(jié)構(gòu)相同，但不同位置的酚羥基會(huì)導(dǎo)致化合物的溶解性差異，更會(huì)導(dǎo)致化合物在脂質(zhì)雙層的分配，與脂質(zhì)體結(jié)合程度的差異，木犀草素能進(jìn)入脂質(zhì)雙層內(nèi)部，而槲皮素和山奈酚主要結(jié)合于脂雙層外部的極性頭部，因此脂質(zhì)環(huán)境中的木犀草素酚羥基去質(zhì)子化能力顯著降低，pKa明顯增大，而后兩種化合物的pKa受脂質(zhì)體影響較小。在脂質(zhì)環(huán)境中，三種化合物與Al3+的螯合能力顯著下降，但差異并不明顯，雖然木犀草素能進(jìn)入脂質(zhì)雙層，但膜流動(dòng)性的增加會(huì)導(dǎo)致Al3+進(jìn)入脂質(zhì)環(huán)境變得困難，因此螯合能力也明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)木犀草素與脂質(zhì)體有較好的親和性。卵磷脂脂質(zhì)體能對(duì)木犀草素起到明顯的穩(wěn)定和保護(hù)作用，但對(duì)槲皮素和山奈酚作用較弱。

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