親水色譜法分析白堅木皮醇的研究

薛 敏，呂 雉，伍 英，姜士寬，陳 婧，孟子暉*

1北京理工大學化工與環(huán)境學院，北京 100081;2云南省熱帶作物研究所，景洪 666100

白堅木皮醇(L-Quebrachitol)具有很高的藥用價值，可治療糖尿病、癌癥、抑制血管增生以及用于抗生素和酶藥物的合成［1-4］。在護膚品、香皂中加入白堅木皮醇，可達到去皺和增加彈性的作用，近年來備受生物、醫(yī)藥專家的關注。另外，由于結構上的單一旋光性手性結構單元，可作為手性試劑，是合成肌醇衍生物的重要原料。白堅木皮醇最早在巴西白堅木的樹皮中發(fā)現(xiàn)，后來證明在銀樺、夾竹桃、紫堇等植物中都存在著白堅木皮醇，含量在0.4% ～0.7%左右。在我國云南地區(qū)，制膠廠每年都會排放大量的制膠廢水，其中白堅木皮醇含量可高達1.2%［5-7］，有報道從天然橡膠的制膠廢液中提取白堅木皮醇［8-12］，所得樣品純度不高，Martina Diaz［13］等人在從膠乳中提取后用1H-NMR對其作了定性，也有從其他植物中提取的，比如 Heikki Kallio［14］等人用5 μm的氨基柱從沙棘果提取液中分離得到白堅木皮醇。

強極性的天然產(chǎn)物水溶性活性成分的色譜分析是當前分析化學以及植物化學領域中的一個挑戰(zhàn)，由于其在傳統(tǒng)的反相色譜(RPLC)中保留能力較弱，因而難以有效分離。而在以硅膠為固定相的正相色譜(NPLC)中會出現(xiàn)峰形前伸或拖尾、保留時間隨進樣量改變、以及流動相中微量水的存在會明顯影響保留值等問題，另外NPLC常用的非極性流動相也無法為水溶性樣品提供足夠的溶解度。近年來興起的親水色譜(Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC)采用水-水溶性有機溶劑作為流動相，極好地改善了樣品在流動相中的溶解性，對強極性和親水性物質有良好的保留，分離效果優(yōu)于傳統(tǒng)RPLC，因此得到越來越廣泛的關注［15，16］，并在極性天然產(chǎn)物活性成分的分析中得到了成功的應用［17-19］。

本研究建立了HILIC法測定白堅木皮醇的分析方法，并對比了親水色譜柱和C18色譜柱在DAD檢測器下的檢測效果，確定最佳檢測條件，對乳清提取物以及制膠廢水等實際樣品進行了分析測試，效果良好，對分離機理進行了討論。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜(日本島津公司);SPDM20A型二極管陣列檢測器(DAD，日本島津公司);KH5200型超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。白堅木皮醇(百靈威科技有限公司);乙腈(MeCN，色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司);制膠廢水和乳清提取物由云南熱帶作物所提供;實驗用水為超純水(艾科浦超純水系統(tǒng))。

1.2 樣品溶液的配制

精確稱取40 mg白堅木皮醇標準品，置于10 mL容量瓶中，加入超純水至刻度，配置成4 mg/mL標準液備用。取10 mL含白堅木皮醇的制膠廢水，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾備用。

1.3 色譜分析

SHISEIDO PC HILIC色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);Agela Venusil MP C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;DAD檢測波長:190 nm。

C18色譜柱檢測條件:取配好的4 mg/mL白堅木皮醇標準液，稀釋成2 mg/mL用于HPLC檢測。色譜柱為Agela Venusil MP C18，流動相為乙腈-水，檢測器為二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長為190 nm，進樣量為 5 μL。

親水色譜柱檢測條件:取配置好的2 mg/mL白堅木皮醇標準液，色譜柱為SHISEIDO PC HILIC，流動相為乙腈-水，檢測器為二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長為190 nm，進樣量為5 μL。

圖1 白堅木皮醇HPLC-DAD色譜圖Fig.1 HPLC-DAD chromatograms of L-quebrachitol with C18column

2 結果與討論

2.1 C18柱檢測白堅木皮醇

從圖1可以看出，白堅木皮醇在C18柱中出峰時間約在2.3 min左右，由于C18反相色譜柱填料極性小，而白堅木皮醇極性較大，所以在柱中幾乎沒有保留。此外，隨著流動相中乙腈的含量由20%增加至80%，白堅木皮醇出峰時間沒有太大變化，保留因子基本不變，這說明C18色譜柱不適合用來分離鑒定白堅木皮醇這種強極性水溶性化合物。

2.2 HILIC分離模式下流動相配比與保留因子的關系

從圖2可以看出，采用SHISEIDO PC HILIC色譜柱、DAD檢測器，隨著流動相中乙腈含量的減少，水含量的增加，即流動相整體極性的增大，白堅木皮醇同HILIC柱上的極性配體磷脂(PC)作用減弱，導致保留時間變短，出峰更快。

圖2 白堅木皮醇HPLC-DAD色譜圖Fig.2 HPLC-DAD chromatograms of L-quebrachitol with SHISEIDO PC HILIC column

實驗比較了乙腈/水不同配比時待測物的分離效果(圖3)，根據(jù)保留因子(k)確定流動相。保留因子反映了物質在柱中的遷移速率，保留因子越大，保留時間越長，如果過長，則峰展較寬，靈敏度不高;若保留因子過小，則在柱內(nèi)保留效果差，不利于分離。

圖3 保留因子同流動相中水含量的關系Fig.3 Effects of Acetonitrile/Water ratio on the retention factor of L-quebrachitol

理論上k=0.5～10均能滿足分離需求，在0.5～1.5之間為最佳，從圖3可以看出，k隨著乙腈含量的減小而減小，在流動相比例為6∶4和5∶5時，保留因子都在1左右，均適合本實驗，但相比之下，比例為6∶4時出峰時間為4.3 min，可以避免溶劑峰的干擾，峰形更對稱，因此本實驗選擇流動相為乙腈/水(V/V，60/40)。

2.3 標準曲線及檢測限

以配制好的4 mg/mL白堅木皮醇標準液為儲備液，分別稀釋成 2、0.8、0.1、0.08、0.05 mg/mL 的標準溶液，以HPLC分別測定包括儲備液在內(nèi)的6個濃度下白堅木皮醇的峰面積，流動相取乙腈-水(V/V)6∶4，以峰面積積分值(y)對白堅木皮醇濃度(x，mg/mL)做線性回歸，得到線性方程，以3倍信噪比(S/N=3)為譜峰值，求出檢測限(如表1)。

表1 白堅木皮醇標準曲線與檢測限Table 1 Standard curve and detection limit of L-quebrachitol

2.4 用色譜條件檢測白堅木皮醇濃縮品

取2 mg/mL乳清提取物溶液，在高效液相色譜檢測，色譜柱為SHISEIDO PC HILIC;流動相為乙腈-水(V/V，60/40);檢測器為二極管陣列檢測器(DAD);檢測波長為190 nm;色譜圖如圖4。

圖4 白堅木皮醇濃縮品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of concentrated L-quebrachitol product

從圖4可以看出，乳清提取物中雖含白堅木皮醇，但仍有較多雜質，利用本研究建立的親水色譜法基本可以將白堅木皮醇和其他雜質分開，出峰時間在4.3 min左右。

2.5 制膠廢水中白堅木皮醇的檢測

將已經(jīng)過處理的含白堅木皮醇的制膠廢水用HPLC檢測，色譜柱為SHISEIDO PC HILIC，流動相為乙腈-水(V/V，60/40)，檢測器選擇 DAD，柱溫為25℃，所得色譜圖在4.3 min左右有一個很明顯的吸收峰，白堅木皮醇和雜質沒能達到很好的基線分離，但根據(jù)相同實驗條件下保留時間推算，基本確定此峰為白堅木皮醇。

圖5 制膠廢水色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of latex wastewater

2.6 分離機理

根據(jù)Alpert的研究［20］，強極性樣品白堅木皮醇在HILIC中的保留是基于分配理論，當使用水溶性有機相-水為流動相時，親水性的固定相表面會產(chǎn)生一層富水層，而化合物就溶解入富水層中。Shiseido PC HILIC色譜柱采用的是硅膠表面鍵合磷酸膽堿(PC)的技術，PC是細胞膜的組成部分，具有三甲胺內(nèi)脂結構。作為超親水性基團，PC修飾于硅膠表面，從而使親水性物質白堅木皮醇在色譜柱內(nèi)有所保留。實驗證明，該色譜柱對水溶性物質具有很好分離性能，同時具有較好的分離的穩(wěn)定性和高效性。

3 結論

根據(jù)白堅木皮醇的水溶性，建立了親水作用色譜柱測定其含量的HPLC方法。解決了常規(guī)C18色譜柱無保留、含量測定不穩(wěn)定的問題。該方法準確、靈敏度高，可用于對基質復雜的制膠廢水中白堅木皮醇的檢測，更精確的檢測條件將進一步研究。該方法對其他天然產(chǎn)物極性水溶性有效成分的色譜分析也有很好的借鑒作用。

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