核桃分心木化學(xué)成分與生物活性研究

楊明珠，田新雁，肖朝江，韓冰洋，姜 北

大理學(xué)院藥學(xué)院，大理 671000

分心木(Diaphragma juglandis Fructus)為胡桃科植物胡桃(Juglans regia L.)果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜，又名胡桃衣、胡桃?jiàn)A、胡桃隔、核桃隔膜。中醫(yī)認(rèn)為，本品性味苦、澀、平，入脾、腎經(jīng)，有健脾固腎、利尿清熱，治淋病尿血、暑熱瀉痢等功效，適用于治療遺溺、崩中下血、耳聾、治遺精、尿頻、帶下等。用核桃分心木泡水喝，具有補(bǔ)腎澀精的功能，對(duì)多汗、尿頻、遺尿、腎虛遺精、口腔潰瘍、牙齦出血、小便多等也有功效，且具有一定的抗菌活性［1］。

胡桃為云南省的重要支柱型經(jīng)濟(jì)林木之一，其中大理地區(qū)為優(yōu)質(zhì)核桃品種漾濞泡核桃(Juglans sigillata Dode)的主產(chǎn)區(qū)，2009年產(chǎn)量達(dá)到12.33萬(wàn)噸［2］，副產(chǎn)品分心木6千噸以上，全省分心木資源蘊(yùn)藏量更是十分巨大。雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)關(guān)于胡桃研究已相當(dāng)廣泛，研究范圍包括核桃仁、核桃殼、核桃青皮、枝葉、樹皮、根皮等，發(fā)現(xiàn)了許多抗腫瘤、抗氧化活性成分，但對(duì)分心木的化學(xué)成分與藥理活性研究報(bào)道卻十分有限，致使分心木(與核桃殼一道)除用于燒制活性炭或作燃料外，基本上無(wú)任何其它方面的應(yīng)用，極大限制了該資源的價(jià)值與用途。因此，如能對(duì)云南豐富的分心木資源進(jìn)行研究利用，變廢為寶，無(wú)疑可為當(dāng)?shù)氐纳鐣?huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，付文煥等曾從鞣質(zhì)定性分析入手研究建立分心木藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法［3-4］;王艷梅、畢肯·阿不得克里木等采用傳統(tǒng)化學(xué)反應(yīng)方法對(duì)分心木的化學(xué)成分進(jìn)行了定性分析，初步推斷其中含有氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類、酚類、有機(jī)酸、黃酮、生物堿、強(qiáng)心苷、揮發(fā)油、甾類、皂苷、蒽醌類、內(nèi)酯、香豆素、油脂等多種成分［5，6］;然而，有關(guān)分心木中單體化學(xué)成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定至今未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)目對(duì)分心木75%乙醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，由乙酸乙酯部位分離鑒定了11個(gè)化合物，本文報(bào)道這些化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及分心木提取物的抗氧化、抗菌活性研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

質(zhì)譜由VG Auto Spec-3000質(zhì)譜儀測(cè)定，電離條件為70 eV;1H與13C NMR由Bruker AM-400核磁共振波譜儀測(cè)定，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)。柱層析硅膠材料、薄層層析板硅膠G和GF254均為青島海洋化工廠生產(chǎn);葡聚糖凝膠為Sephadex LH-20(Amersham Biosciences，Sweden);氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇均為工業(yè)純?cè)噭?，正丁醇、氯化鈉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)均為分析純?cè)噭?1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Aldrich Chem Co，USA)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，液體沙氏培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，瓊脂粉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管，濾紙、接種環(huán)、微量加樣器等。核桃分心木(Diaphragma juglandis Fructus)采于云南省大理州漾濞縣，由大理學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室周濃副教授鑒定。標(biāo)本(DLYX-JIANG-2009-10-01)存放于大理學(xué)院藥學(xué)院姜北教授研究組。菌種:所有菌種均由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室提供，包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、痢疾桿菌、H901傷寒桿菌、白色念珠菌。

1.2 提取與分離

核桃分心木10.0 kg，粉碎后用75%乙醇冷浸提取，濃縮后得到浸膏1.1 kg，用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得相應(yīng)提取物。取200 g乙酸乙酯萃取浸膏，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，用氯仿-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脫，得Fr1～Fr7七個(gè)部分。Fr2經(jīng)硅膠柱層析石油醚-乙酸乙酯洗脫后得化合物1、2和4，相應(yīng)部位再經(jīng)Sephadex LH-20純化后得3，經(jīng)RP-18反相層析得6。Fr3經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-丙酮、石油醚-丙酮洗脫后，再經(jīng)Sephadex LH-20純化得10;相應(yīng)部位經(jīng)RP-18反相層析得5;用石油醚-丙酮系統(tǒng)硅膠柱層析粗分，再經(jīng)Sephadex LH-20、石油醚-乙酸乙酯硅膠柱層析、重結(jié)晶后得9;經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)硅膠柱層析得8和11。Fr4經(jīng)硅膠柱層析氯仿-丙酮、石油醚-丙酮洗脫，再用Sephadex LH-20純化，經(jīng)重結(jié)晶得7。

1.3 抗氧化活性測(cè)試

核桃分心木75%乙醇粗提物(A)，經(jīng)D100大孔樹脂柱梯度洗脫，得水部分浸膏(B)、50%乙醇部分浸膏(C)、95%乙醇部分浸膏(D);50%乙醇部分浸膏再用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯提取物(E)、正丁醇提取物(F)和萃取剩下的水相 (G)。精確稱量樣品提取物10 mg左右，溶解在2 mL DMSO中，之后用 DMSO按1∶3、1∶1、1∶1、1∶1 的比例稀釋。以 DMSO、維生素 C 分別作為對(duì)照，在96孔板上用50 μL供試品與150 μL DPPH(400 mmol·L-1)液混合，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中30分鐘，之后用酶標(biāo)儀于515 nm處測(cè)定OD值，最后計(jì)算出供試品的IC50數(shù)值。

1.4 抗菌活性供試樣品

準(zhǔn)確稱取供試樣品2.0 g溶于20 mL滅菌蒸餾水中，超聲溶解，吸取上清液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，備用。剩下的不溶物冷凍干燥，扣除其重量，從而計(jì)算藥物原液的濃度。

1.5 紙片擴(kuò)散法抗菌活性測(cè)試［7］

將厚度為1.5 mm的優(yōu)質(zhì)定性濾紙用打孔機(jī)制成直徑為6 mm的小圓片，置于培養(yǎng)皿中滅菌，烘干。然后放到藥物原液中浸泡2 h，待用。用接種環(huán)挑取待測(cè)菌體置于少量生理鹽水中，配制成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，待用。取100 μL菌懸液置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，用滅菌棉簽均勻涂開，將含藥濾紙片分別貼于平板表面，37℃培養(yǎng)18 h，根據(jù)藥敏紙片周圍顯出的抑菌圈大小來(lái)判斷抗菌作用的強(qiáng)弱，通過(guò)此法初步篩選敏感細(xì)菌譜。對(duì)照組為生理鹽水。

1.6 肉湯稀釋法抗菌活性測(cè)試［7］

將藥物原液用蒸餾水按1∶1稀釋成系列藥液。取M-H肉湯商品培養(yǎng)基制成M-H肉湯，滅菌后備用。然后向各稀釋藥液中加入M-H肉湯，混合均勻，即成含藥肉湯。用接種環(huán)取適量測(cè)試菌，用3～5 mL的生理鹽水校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用M-H肉湯1∶10稀釋，使含菌量達(dá)到107CFU·mL-1。用微量加樣器取0.1 mL稀釋菌液由低藥物濃度向高藥物濃度加于各稀釋藥液中，每種提取物和其相關(guān)的每一種敏感菌均同時(shí)進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn);37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h(白色念珠菌培養(yǎng)48 h)后，將各藥物的菌液分別接種到 M-H培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)劃線處細(xì)菌生長(zhǎng)情況判斷該種藥物的最小抑菌濃度。對(duì)照組采用測(cè)試菌生長(zhǎng)對(duì)照方式進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色結(jié)晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz) δ:12.20(1H，s，-OH)，12.07(1H，s，-OH)，7.56(1H，s，H-4)，7.25(1H，d，J=2.3 Hz，H-5)，7.14(1H，s，H-2)，6.66(1H，d，J=2.3 Hz，H-7)，2.47(3H，s，-CH3);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:166.2(C-1)，108.8(C-2)，149.5(C-3)，109.6(C-4)，134.2(C-4a)，121.4(C-5)，163.2(C-6)，124.9(C-7)，166.3(C-8)，114.0(C-8a)，191.7(C-9)，110.0(C-9a)，182.1(C-10)，136.6(C-10a)，21.9(-CH3)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，確定化合物1為大黃素。

化合物2 白色粉末，易溶于氯仿，1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ:0.75，0.77，0.90，0.91，0.92，0.98，1.13(各 3H，s，CH3× 7);13C NMR(CD3Cl，125 MHz)δ:38.4(C-1)，27.0(C-2)，79.0(C-3)，38.7(C-4)，55.2(C-5)，18.3(C-6)，32.7(C-7)，39.3(C-8)，47.6(C-9)，37.2(C-10)，23.0(C-11)，122.4(C-12)，143.8(C-13)，41.6(C-14)，27.7(C-15)，23.4(C-16)，46.3(C-17)，41.2(C-18)，45.9(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.5(C-22)，28.1(C-23)，15.5(C-24)，15.3(C-25)，16.9(C-26)，25.9(C-27)，181.1(C-28)，33.0(C-29)，23.5(C-30)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］一致，化合物2鑒定為齊墩果酸。

化合物3 白色結(jié)晶，易溶于氯仿、丙酮，1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:12.45(1H，s，OH-8)，7.52(1H，dd，J=7.5，8.4 Hz，H-6)，7.11(1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，6.82(1H，d，J=8.4 Hz，H-7)，4.65(1H，d，J=5.6 Hz，H-4)，2.88(1H，m，H-2b)，2.69(1H，m，H-2a)，2.37(1H，m，H-3b)，2.15(1H，m，H-3a);13C NMR(CD3COCD3，125 MHz)δ:204.1(C-1)，35.9(C-2)，32.5(C-3)，67.7(C-4)，149.1(C-4a)，118.3(C-5)，137.5(C-6)，117.1(C-7)，163.3(C-8)，115.9(C-8a)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］基本一致，化合物3鑒定為Isosclerone。

化合物4 白色粉末，溶于氯仿，在TLC上三種不同溶劑系統(tǒng)展開時(shí)化合物4與正十七烷標(biāo)準(zhǔn)品Rf值一致，故化合物鑒定為正十七烷。

化合物5 白色結(jié)晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，500 MHz)δ:7.91(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.91(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，3.90(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，H-9)，3.12(2H，t，J=6.0，H-8);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:135.6(C-1)，136.5(C-2，6)，121.1(C-3，5)，167.9(C-4)，203.2(C-7)，46.7(C-8)，63.8(C-9)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］相似，化合物5鑒定為3-羥基-1-(4-羥基取代苯基)-1-丙酮。

化合物6 白色片狀結(jié)晶，易溶于氯仿，1H NMR(C5D5N，500 MHz)δ:4.20(2H，dd，J=4.5，11.6 Hz，H-1)，4.15(1H，d，J=9.0 Hz，OH-2)，3.93(1H，m，H-2)，3.70(1H，dd，J=3.9，11.4 Hz，H-3a)，3.60(1H，dd，J=5.8，11.4 Hz，H-3b)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H-2’)，1.62(2H，t，J=7.0 Hz，H-3’)，1.25(28H，m，H-4’～ 17’)，0.88(3H，t，J=6.7 Hz，H-18’)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］基本一致，化合物6鑒定為硬脂酸甘油單酯。

化合物7 白色結(jié)晶，易溶于丙酮，ESI-MS m/z:169 ［M-H］－;1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.13(2H，s，H-2，6)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］基本吻合，在TLC上與沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品Rf值一致，化合物7鑒定為沒(méi)食子酸。

化合物8 白色結(jié)晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.11(2H，s，H-2，6)，4.24(2H，q，J=7.1 Hz，-OCH2-)，1.30(3H，t，J=7.1 Hz，-CH3);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:122.1(C-1)，109.7(C-2，6)，146.0(C-3，5)，138.5(C-4)，166.6(C=O)，60.8(-OCH2-)，14.6(-CH3)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13，14］基本一致，化合物8鑒定為沒(méi)食子酸乙酯。

化合物9 白色結(jié)晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.94(2H，d，J=8.7 Hz，H-3，5)，6.95(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6)，5.07(1H，br s，H-8)，3.86(1H，dd，J=3.4，11.2 Hz，H-9a)，3.77(1H，dd，J=4.2，11.2 Hz，H-9b);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:127.4(C-1)，116.1(C-2，6)，132.0(C-3，5)，163.1(C-4)，198.8(C-7)，75.0(C-8)，66.2(C-9)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］基本一致，化合物9鑒定為核桃素 D。

化合物10 白色結(jié)晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.91(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.91(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:122.5(C-1)，115.8(C-2，6)，132.7(C-3，5)，162.4(C-4)，167.6(C-7)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］基本一致，化合物10鑒定為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物11 淡黃色針晶，易溶于甲醇，1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.58(1H，dd，J=1.5，8.0 Hz，H-6)，7.55(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)，6.90(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，3.89(1H，s，-OCH3);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:122.8(C-1)，115.4(C-2)，147.9(C-3)，152.6(C-4)，113.3(C-5)，124.7(C-6)，167.3(C-7)，56.3(-OCH3)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］基本一致，確定化合物11為香草酸。

2.2 抗氧化活性測(cè)試

由分心木提取物衍生出的樣品A-G的抗氧化活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 供試樣品的抗氧化IC50值Table 1 The antioxidant IC50values of the fractions extracted from Diaphragma juglandis

2.3 抗菌活性測(cè)試

3 討論

實(shí)驗(yàn)中由分心木提取物中分離鑒定了11個(gè)化合物，這是首次由分心木中分離報(bào)道單體成分，主要為多酚類、有機(jī)酸、醌類及萜類等。從我們的研究結(jié)果可以看出，分心木提取物中小分子部分普遍具有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)，其乙酸乙酯部位的抑菌作用明顯強(qiáng)于其它各個(gè)提取物部位，說(shuō)明乙酸乙酯部位是抗菌的有效部位;由該部位分離得到的單體成分沒(méi)食子酸乙酯(8)也顯示出很好的抗菌活性與較大抗菌譜，間接證實(shí)分心木被用于治療淋病、血尿、帶下、瀉痢、腎炎等病癥具有一定的科學(xué)依據(jù)。本研究對(duì)于深入了解分心木的活性成分與藥用價(jià)值具有重要意義。

表2 紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Testing results for antibacterial activities(disk diffusion method)

表3 常量肉湯稀釋法Table 3 Testing results for antibacterial activities(broth dilution method)

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