地膽草與白花地膽草脂溶性成分的GC-MS分析及抑菌活性研究

王 蓓，梅文莉，左文健，曾艷波，劉國道 ，戴好富，

1海南大學園藝園林學院，?？?570228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，海口 571101;3中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737

菊科地膽草屬(Elephantopus)植物約有30余種，大部分分布于美洲，亞洲有少數(shù)分布。我國有地膽草(E.scaber)和白花地膽草(E.tomentosus)2種，分布于華南和西南地區(qū)［1］。地膽草屬植物為中藥苦地膽的原植物，苦地膽是我國長江以南地區(qū)，尤其是港臺地區(qū)一味常用民間藥［2］。民間認為苦地膽具有清熱、涼血、利濕的功效，主治感冒、百日咳、咽炎、結(jié)膜炎、腎炎、濕疹、蟲咬傷等。海南黎族取其全草用于煲湯，水煎可作茶飲［3］。自70年代以來，美國和日本學者相繼報道該屬植物含有抗腫瘤活性的倍半萜內(nèi)酯類化合物［4］和抗糖尿病活性成分奎寧酸類化合物［5］?，F(xiàn)代藥理學研究表明地膽草具有解熱和降血壓［6］、保肝［7］和抗菌［8］等藥理活性，其主要含有倍半萜內(nèi)酯、三萜、黃酮、有機酸等化學成分，而白花地膽草的相關研究較少。為尋找地膽草與白花地膽草的差異，我們首次用GC-MS聯(lián)用技術對海南產(chǎn)的這兩種植物的脂溶性成分進行分離鑒定;并分別對其脂溶性成分對金黃色葡萄球菌和耐甲氧金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用進行了初步探索，為更廣泛地開發(fā)和利用地膽草屬資源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

地膽草(E.scaber)與白花地膽草(E.tomentosus)于2010年10月采自海南省昌江縣霸王嶺，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所代正福副研究員鑒定，憑證標本(ES201010;ET201010)存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所。取地膽草全草及白花地膽草全草粉末各1.0 kg，分別用95%的乙醇室溫超聲提取3次，每次30 min。提取液減壓濃縮至無醇味。將地膽草與白花地膽草乙醇提取物分別分散于水中，用石油醚萃取，減壓回收溶劑，從而得到地膽草石油醚萃取物9.5 g與白花地膽草石油醚萃取物7.3 g。

1.2 儀器及分析條件

儀器為美國惠普公司的HP6890/5973 GC-MS聯(lián)用儀。氣相色譜條件:HP-Innowax Polyethylene Glycol(30.0 m(320 μm(0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫50℃(保留1 min)，以5℃/min升溫至300℃，保持2 min;汽化室溫度250℃;載氣為高純 He(99.999%);柱前壓 7.62 psi，載氣流量 1.0 mL/min;進樣量 1 μL;分流比 20∶1。

質(zhì)譜條件:離子源為EI源;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓837 V;接口溫度280℃;質(zhì)量范圍10 ～ 550 amu。

數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索:通過HPMSD化學工作站，結(jié)合NIST2005標準質(zhì)譜圖庫和WILEY275質(zhì)譜圖庫進行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計算相對含量。

1.3 菌株與培養(yǎng)基

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)ATCC 9551、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 5165由海南省藥品檢驗所提供。MRSA和S.aureus均采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［9］:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，定容至1 L，pH 7.0 ～ 7.2，1 ×105Pa滅菌20 min。

1.4 抗菌活性的測定

將兩種植物脂溶性成分分別加入三氯甲烷配制成濃度梯度為100、200 mg/mL的樣品溶液，選用直徑為6 mm的滅菌濾紙片，濾紙片分別加上述梯度樣品溶液25 μL，每個梯度重復三次，待溶劑揮干后，將已點樣的濾紙片貼于已涂供試菌懸液100 μL(菌液濃度105(107cfu/mL)的瓊脂培養(yǎng)基上，放置20 min后，再放入培養(yǎng)箱37℃無光照培養(yǎng)，24 h后測其抑菌圈大小。MRSA與S.aureus均以硫酸卡那霉素作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS 分析結(jié)果

應用GC-MS技術分別對地膽草與白花地膽草的脂溶性成分進行測定，通過HPMSD化學工作站，結(jié)合NIST2005標準質(zhì)譜圖庫和WILEY275質(zhì)譜圖庫進行結(jié)構(gòu)鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計算相對含量，兩者成分見表1。

表1 地膽草與白花地膽草全草脂溶性成分及含量Table 1 Constituents and contents of liposoluble components of E.scaber and E.tomentosus

(E)-2-Decenal(E)-2-癸烯醛 C10H18O 154 15.60 － 0.15 10 (E，E)-2，4-Decadienal (E，E)-2，4-癸二烯醛 C10H16O 152 16.38 － 0.25 11 Tridecane十三烷 C13H28 184 16.41 0.45 －12 (E，Z)-2，4-Decadienal(E，Z)-2，4-癸二烯醛 C10H16O 152 16.91 － 0.35 13 Tetradecane十四烷 C14H30 198 18.66 1.02 －14 Methyl 9-oxononanoate 9-羰基壬酸甲酯 C10H18O3 186 19.45 － 0.59 15 Pentadecane十五烷 C15H32 212 20.77 2.01 －16 Nerolidol oxide橙花叔醇氧化物 C15H26O3 254 22.03 － 0.40 17 Ochracin赭曲菌素 C10H10O3 178 22.05 4.40 －18 Hexadecane十六烷 C16H34 226 22.78 2.29 －19 Decyl cyclohexane癸基環(huán)己烷 C16H32 224 23.88 0.72 －20 Heptadecane十七烷 C17H36 240 24.67 2.16 －21 Octadecane十八烷 C18H38 254 26.45 0.47 －22 Neophytadiene新植二烯 C20H38 278 27.16 － 0.54 23 6，10，14-Trimethyl-2-pentadecanone 植酮 C18H36O 268 27.27 0.41 0.77 24 Isobutyl phthalate鄰苯二甲酸二異丁基酯 C16H22O4 278 27.75 2.14 －25 Nonadecane十九烷 C19H40 268 28.16 0.33 －26 Bis(methoxyethyl)phthalate鄰苯二甲酸二甲氧乙酯 C14H18O6 282 28.53 0.96 －27* Methyl palmitate 棕櫚酸甲酯 C17H34O2 270 28.68 11.69 19.76 28 Butyl phthalate鄰苯二甲酸二丁酯 C16H22O4 278 29.32 0.94 －29* Ethyl palmitate 棕櫚酸乙酯 C18H36O2 284 29.72 0.48 0.24 30 Eicosane二十烷 C20H42 282 29.81 0.57 －31* Methyl 14-methyl hexadecanoate 14-甲基棕櫚酸甲酯 C18H36O2 284 30.25 0.30 0.35 32 (E)-5-Eicosene(E)-5-二十烯 C20H40 280 31.22 － 0.45 33 Ethyl linoleate 亞油酸乙酯 C19H34O2 294 31.42 12.55 10.76 34 Methyl 9，12，15-octadecatrienoate 亞麻酸甲酯 C19H32O2 292 31.53 9.73 8.65 35 Phytol葉綠醇 C20H40O 296 31.69 0.84 0.58 36 Methyl stearate 硬脂酸甲酯 C19H38O2 298 31.83 1.47 2.17 37 Ethyl linolenate亞麻酸乙酯 C20H34O2 306 32.47 0.64 －38 Docosane二十二烷 C22H46 310 32.89 0.71 －39 Tricosane二十三烷 C23H48 324 34.33 0.93 －40 Methyl arachate花生酸甲酯 C19H38O2 298 34.73 － 0.29 41 Linoleic acid亞麻油酸 C18H32O2 280 34.82 － 1.00 42 Tetracosane二十四烷 C24H50 338 35.71 0.86 －43 Pentacosane二十五烷 C25H52 352 37.05 0.90 －44 Octoil辛基油 C24H38O4 390 37.82 16.65 －45 Hexacosane二十六烷 C26H54 366 38.33 1.07 －46 Heptacosane二十七烷 C27H56 380 39.57 1.13 －47 Octacosane二十八烷 C28H58 394 40.77 1.26 －48 Nonacosane二十九烷 C29H60 408 41.92 0.93 －49 Triacontane三十烷 C30H62 422 43.04 1.17 －50 Hentriacontane三十一烷 C31H64 436 44.11 1.32 －9

51 Dotriacontane三十二烷 C32H66 450 45.17 1.28 －52 Tritriacontane三十三烷 C33H68 464 46.18 1.57 －53 α-Amyrin α-香樹脂醇 C30H50O 426 47.15 － 3.55 54 Tetratriacontane三十四烷 C34H70 478 47.17 0.96 －55 Lup-20(29)-en-3-one羽扇烯酮 C30H48O 424 47.35 － 5.39 56* Lupeol羽扇豆醇 C30H50O 426 47.68 4.14 20.95 57* β-Amyrin β-香樹脂醇 C30H50O 426 48.72 2.03 3.93總量(Total contents)93.72% 82.08%

從地膽草樣品中鑒定出44個化合物，占色譜總餾分出峰面積的93.72%，含量大于1%的有21個，含量大于5%的有4個。其中含量最高的為辛基油(16.65%)，其次為亞油酸乙酯(12.55%)、棕櫚酸甲酯(11.69%)、亞麻酸甲酯(9.73%)。

從白花地膽草樣品中鑒定出25個化合物，占色譜總餾分出峰面積的82.08%，含量大于1%的有9個，含量大于5%的有5個。其中含量最高的為羽扇豆醇(20.95%)，其次為棕櫚酸甲酯(19.76%)、亞油酸乙酯 (10.76%)、亞麻酸甲酯(8.65%)、羽扇烯酮(5.39%)。

地膽草和白花地膽草的共有成分12個，包括棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯、14-甲基棕櫚酸甲酯、葉綠醇、植酮、硬脂酸甲酯、(Z)-2-庚烯醛、辛酸甲酯、羽扇豆醇和β-香樹脂醇。

2.2 活性測定結(jié)果

以濾紙片瓊脂擴散法測定脂溶性成分的抑菌活性，其兩種濃度的抑菌活性結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，地膽草和白花地膽草的脂溶性成分對S.aureus和MRSA都具有抑制作用，且白花地膽草的抑菌活性強。

表2 地膽草與白花地膽草脂溶性成分的抗菌活性(mm，n=3)Table 2 Anti-bacterial activities of liposoluble components of E.scaber and E.tomentosus(mm，n=3)

3 討論

表1顯示，地膽草存在脂肪酸成分12個，飽和烴類25個，萜類成分3個，烯醛類成分2個和其他醇酮類等化學成分。其中脂肪酸類化合物的總含量最高 57.58%，其次為飽和烴類 24.27%、萜類7.01%、烯醛類0.05%。白花地膽草存在脂肪酸成分10個，萜類成分8個，烯醛類成分4個和其他醇酮類等化學成分。其中脂肪酸類化合物的總含量最高44.14%，其次為萜類35.79%、烯醛類1.15%?？梢姷啬懖莺桶谆ǖ啬懖莸臒N類成分和萜類成分總含量存在一定的差異。

兩者的共有成分中包括7個脂肪酸成分，3個萜類成分，1個烯醛類成分，一個烷酮類成分。脂肪酸成分除棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯外，在白花地膽草中的含量均高于在地膽草的含量;萜類成分除葉綠醇，在白花地膽草中含量高于地膽草含量。

萜類化合物在白花地膽草中的含量(35.79%)高于地膽草(7.01%)，植物精油中的萜類成分具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤和影響植物生長等生物活性［10］，表明萜類化合物是地膽草屬植物的藥效成分之一。白花地膽草中主要成分羽扇豆醇(20.95%)據(jù)報道是具有抗腫瘤活性的三萜類化合物［11］，其在地膽草中僅占(4.14%)，而三萜類化合物羽扇烯酮(5.39%)、α-香樹脂醇(3.55%)在地膽草中均未檢出。β-香樹脂醇在白花地膽草和地膽草中分別為3.93%、2.03%，其與α-香樹脂醇具有抗炎和明顯減緩福爾馬林和辣椒素引起的面部疼痛作用［12］，表明α-香樹脂醇和β-香樹脂醇可成為地膽草屬植物抗炎、鎮(zhèn)痛的有效成分。

本文測定了地膽草和白花地膽草脂溶性成分對S.aureus和MRSA的體外抑菌作用，得知白花地膽草脂溶性成分對S.aureus和MRSA抑制作用均較強，而地膽草弱之，已有實驗表明地膽草屬植物中的倍半萜內(nèi)酯類和三萜類化合物對多種細菌也有廣泛的抗菌作用，推測兩種植物中萜類成分含量不同因而抑菌活性有所差異。本文為地膽草屬資源的進一步研究和開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

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