糯米香茶中角鯊烯含量的RP-HPLC測定

楊 婷，孫智達，謝筆鈞，胡崇琳

華中農業(yè)大學食品科學技術學院，武漢 430070

糯米香茶(Strobilanthes tonkinesis Lindau)，為爵床科馬藍屬多年生草本植物［1］。因其具有獨特的糯米清香而得名，它含有豐富的芳香成分和對人體有益的氨基酸，具有清熱解毒、養(yǎng)顏抗衰、補腎健胃的功效，被譽為“美容茶”［2］。近年來研究人員發(fā)現糯米香茶中含有豐富的生物活性物質角鯊烯，使得糯米香茶成為提取角鯊烯的潛在植物資源，有待進一步開發(fā)利用。

角鯊烯是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，化學名稱為 2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯酸，具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞、增強免疫調節(jié)及新陳代謝等作用［3］。角鯊烯最早發(fā)現于深海鯊魚肝臟中，后研究人員從植物中提取得到不同含量的角鯊烯，其中譚樂和等人發(fā)現糯米香茶中角鯊烯含量較為豐富［4］，但尚未建立準確測定糯米香茶中角鯊烯含量的檢測方法。本文在前人的基礎上建立一種反相高效液相色譜(RPHPLC)準確測定糯米香茶中角鯊烯含量的方法，為進一步的研究工作奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器:waters e2695高效液相色譜儀，PAD檢測器，色譜柱:DiamonsilTMC18;X-1001型旋轉蒸發(fā)器;SH2-III型循環(huán)水真空泵;Fuhe HH-4數顯恒溫水浴鍋;

試劑:甲醇、乙腈均為色譜純(Tedia，美國);石油醚(30～60℃)為分析純(中國醫(yī)藥集團上海化學試劑有限公司);角鯊烯標準品(Sigma，美國)，純度99%;

1.2 實驗材料來源

糯米香茶原種采自云南景洪一農家茶園，種植在華中農業(yè)大學溫室。取成熟葉片，陰干后用于提取角鯊烯。

1.3 色譜條件

C18色譜柱(200 ×4.6 mm，5 um)(迪馬，美國)，流動相甲醇/乙腈體積比為60/40(v/v)，采用等度洗脫，流速為1.2 mL/min，檢測波長設定為 210 nm［5-7］。

1.4 樣品制備

采用索氏提取法提取糯米香茶角鯊烯:稱取20.0020 g糯米香茶干燥粉末(40目)并用濾紙包裹裝入索氏提取器中，控制水浴溫度恒為60℃，加入500 mL含有0.5%BHT的石油醚(30～60℃)回流提取10 h后浸泡8 h，收集石油醚提取液并用旋轉蒸發(fā)儀除去石油醚，得到深綠色脂溶物，用甲醇定容至 50 mL 容量瓶中［3，8-10］。

1.5 標準溶液的制備

精密稱取角鯊烯標準品25.9 mg，用無水甲醇定容至25 mL容量瓶中，超聲波輔助溶解，得到濃度為1.036 mg/mL的標準溶液，稀釋 10倍得到0.1036 mg/L的標準溶液。

2 方法與結果

2.1 流動相的選擇

角鯊烯為不飽和的烴類化合物，采用反相色譜檢測提取液中角鯊烯含量，調整甲醇/乙腈的比例進行測試，得出在甲醇∶乙腈=60∶40(v/v)時有較好的分離效果，色譜圖如圖1所示。并設定檢測波長為210 nm，總流速為1.2 mL/min，柱溫控制在40℃。在此色譜條件下標準溶液和樣品色譜得到充分分離，標品角鯊烯保留時間為18.970 min，樣品中角鯊烯保留時間為18.989 min，兩者保留時間基本一致［5-6，11-14］。

圖1 標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of the standards

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample

2.2 檢測波長的確定

角鯊烯標準品(Rt=18.970 min)的紫外波長圖譜顯示角鯊烯最大吸收波長為203.6 nm，索氏提取法提取的糯米香茶中角鯊烯(Rt=18.989 min)的紫外波長圖譜與標準品相符，最大吸收波長亦為203.6 nm。認為在該色譜條件下角鯊烯的最大吸收波長即為203.6 nm。如圖3，4所示。

2.3 標準曲線繪制

準確吸取標準溶液，依次進樣 4，8，12，16，20 uL，按2.3色譜條件測定峰面積，以峰面積對進樣量進行回歸分析，得角鯊烯的回歸方程為 Y=344.04X – 21.677，R2=0.9999 ，結果表明角鯊烯在 0.4144 ～ 2.0720 ug 范圍內線性關系良好［5，6］。

表1 標準曲線測定結果Table 1 The standard curve

2.4 進樣精密度試驗

以0.1036 mg/L的標準品溶液連續(xù)進樣6次，每次進樣體積為20 uL，按照2.3 HPLC色譜條件測定峰面積，結果如表2，相對標準偏差RSD=0.56%(n=6)。

表2 角鯊烯精密度試驗結果Table 2 The result of accuracy test(n=6)

2.5 回收率試驗

采用加樣回收法，精確稱量20.0000 g糯米香茶粉末，采用1.4索氏提取法提取樣品溶液，精確量取3.0 mL的樣品溶液三份至潔凈的帶塞試管中，分別加入 1.0、2.0、3.0 mL 濃度為 0.1036 mg/mL 的標準品溶液，超聲助溶10 min，進行HPLC法定量分析，結果如表3所示。符合《中國藥典》2005版第 I部 95% ～ 105% 的規(guī)定［7，15，16］。

表3 回收率試驗結果Table 3 The result of recovery experiment

2.6 供試液穩(wěn)定性試驗

精密稱取糯米香茶干燥粉末樣品20.0000 g，按照1.4提取方法制成供試液，每隔40 min進樣1次，按1.3 HPLC色譜條件測定峰面積并計算出角鯊烯含量，結果見表4。

經計算得到峰面積平均值為4049.527 v·s，RSD為 1.41%，符合《中國藥典》2005年版 I部RSD＜2% 的要求，表明采用索氏提取法提取得到的供試液穩(wěn)定性較好。

表4 供試液穩(wěn)定性試驗結果Table 4 The result of sample stability test

2.7 樣品測定

精確吸取樣品溶液4 uL進樣，采用外標法計算樣品中角鯊烯含量，計算得出20 g糯米香茶粉末中角鯊烯平均含量約為14.79 mg，即0.0739% 。

3 結論

建立測定糯米香茶中角鯊烯含量的高效液相色譜法，證實糯米香茶中含有豐富的生物活性物質角鯊烯，其含量約為72.71 mg/100 g糯米香茶干燥粉末。

實驗確定高效液相色譜條件為:DiamonsilTM C18色譜柱，流動相為甲醇/乙腈=60/40，檢測波長為203 nm，流速為1.2 mL/min，柱溫40℃。在此條件下角鯊烯標準品及糯米香茶中角鯊烯分離效果均良好，HPLC測定方法經檢驗其線性關系、精密度、回收率、供試液穩(wěn)定性等均符合分析要求。該方法適用于糯米香茶中角鯊烯含量的測定。

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