不同品種荷葉HPLC指紋圖譜研究

丁亞平，邢少青，張成森，胡中立，歐陽(yáng)天贄，靳素榮*

1武漢理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系;2武漢大學(xué)蓮藕中心，武漢 430070

荷葉(Lotus leaf)為睡蓮科蓮屬(Nelumbl Nuciferea Gaertn)植物的葉，資源豐富、分布廣泛，在我國(guó)各省普遍栽培，是一種既是食品又是藥品的天然植物原料［1］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，荷葉苦、平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有清解暑熱，升發(fā)清陽(yáng)，涼血止血的功效。研究表明荷葉具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抑菌消炎［2-5］等功能。目前有關(guān)荷葉的研究主要集中在荷葉中活性化學(xué)成分的提取及功能研究等方面［6-9］。荷葉提取物化學(xué)成分復(fù)雜，其藥理活性大多是多成分之間協(xié)同作用的結(jié)果，但目前提取物質(zhì)量及藥效的控制仍沿用定量分析總黃酮、總生物堿等幾種主要成分的陳舊模式，不足以全面評(píng)價(jià)荷葉提取物質(zhì)量的優(yōu)劣。因此本研究采用HPLC色譜法對(duì)不同品種荷葉樣品進(jìn)行了指紋圖譜研究，為荷葉藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑和藥材

主要儀器:Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent化學(xué)工作站，依利特UV230+紫外-可見檢測(cè)器，色譜柱:依利特 Sino Chrom(4.6 mm ×200 mm，5 μm)柱，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

主要試劑:甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、磷酸氫二鈉為優(yōu)級(jí)純，水為重蒸水，槲皮素對(duì)照品(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號(hào):F20061117)。

藥材:荷葉樣品由武漢大學(xué)蓮藕研究中心提供，見表1。

表1 荷葉測(cè)試樣品Table 1 The serial numbers and sources of Lotus leaf samples

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取槲皮素對(duì)照品適量，甲醇溶解，配制成濃度為0.2000 mg/mL的溶液，作為參照物溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取不同品種荷葉干粉約2 g，加入10%乙醇溶液120 mL，浸提6 h，過濾，減壓蒸餾，甲醇溶解，定容至100 mL，搖勻，各樣品溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為荷葉樣品供試液。

2.3 色譜條件

色譜柱:依利特 Sino Chrom(4.6 mm×200 mm，5 μm);流速:1.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量:10 μL.流動(dòng)相:由A、B兩相組成，A 相為乙腈，B 相為 H3PO4-NaH2PO4(0.1 mol/L，pH 2.5)溶液，梯度洗脫程序見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of mobile phase

2.4 樣品測(cè)定方法

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 uL，在擬定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)分析比較各樣品的色譜圖，從中選定了12個(gè)共有峰作為構(gòu)成指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰，見圖1和圖2。其中12號(hào)峰為荷葉主要指標(biāo)成分槲皮素，將其作為參照峰，令其保留時(shí)間和峰面積分別為1，其他各峰的保留時(shí)間和峰面積分別與參照峰的保留時(shí)間和峰面積相比，作為各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

圖1 槲皮素對(duì)照品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取泰籽11號(hào)樣品制備的同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果表明，所得各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.077% ～0.33%，相對(duì)峰面積的RSD為1.04% ～2.99%，均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取泰籽11號(hào)荷葉制備的同一供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h 按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖中各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，指紋圖譜的全貌無明顯變化，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.083% ～0.46%，相對(duì)峰面積RSD為1.04% ～1.88%，均小于3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取泰籽11號(hào)樣品5份，按照供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.37% ～1.06%，相對(duì)峰面積的RSD為1.37% ～2.57%，均小于3%。表明方法的重復(fù)性良好。

圖3 10批不同品種荷葉HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of different variety Lotus leaves

3.4 指紋圖譜的建立與分析

按照上述測(cè)定方法，對(duì)1～10號(hào)樣品按2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)試。通過對(duì)10批荷葉供試品的測(cè)定，以槲皮素對(duì)照品做荷葉指紋圖譜的參照物，比較各批樣品的色譜圖發(fā)現(xiàn)，其中12個(gè)峰是10批荷葉共有的，因此確定它們?yōu)楣灿蟹?圖3)。以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算10批供試品圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3、表4。

表3 10批荷葉樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Table 3 Relative retention times of common peaks for ten batches of Lotus leaves

表4 10批荷葉共有峰的相對(duì)峰面積Table 4 Relative peak areas of common peaks for ten batches of Lotus leaves

4 討論

本研究首次建立了荷葉HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明其指紋圖譜相互間較為吻合，雖然由于樣品的個(gè)體差異，特征峰的相對(duì)量存在一定的差異，但整體輪廓均符合共有特征。同時(shí)從其整體色譜圖入手，選取了12個(gè)特征峰構(gòu)成了荷葉的指紋圖譜，以共有模式作為荷葉的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，能提供更全面的質(zhì)量控制信息。實(shí)驗(yàn)證明該方法操作性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可以作為荷葉內(nèi)在質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)方法，同時(shí)也可作為荷葉主成分制劑指紋圖譜研究的基礎(chǔ)。

4.1 樣品處理方法選擇

對(duì)荷葉樣品，最初采用30%乙醇微波輔助提取處理，直接進(jìn)樣，從其色譜圖上可明顯看出，樣品出峰聚集在10 min以前，給鑒別造成很大困難，選用10%乙醇浸提后，使色譜圖的整體面貌得以改善。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

黃酮類物質(zhì)在紫外-可見區(qū)域有兩個(gè)吸收峰，分別在240～285 nm和300～360 nm處，本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)在240～360 nm各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大于280 nm波長(zhǎng)下其色譜圖基線噪音較大，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的基線漂移現(xiàn)象，且樣品出峰數(shù)少，分離度較差。而在小于280 nm波長(zhǎng)下，其色譜圖基線噪音較低，所洗脫的組分均有較高的響應(yīng)值，且分離度好，綜合比較后選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.3 流動(dòng)相的選擇

在實(shí)驗(yàn)過程中比較了不同pH的甲醇-水、乙腈-水溶液和乙腈-磷酸鹽緩沖液。結(jié)果表明，乙腈-磷酸鹽緩沖液梯度洗脫系統(tǒng)為最佳，各色譜峰分離度較好，保留時(shí)間適中，并且所有成分均在60 min內(nèi)出峰。

色譜指紋圖譜是通過比較各樣本間色譜圖的差異來反映樣品化學(xué)成分間的差異，不同品種荷葉的指紋圖譜相似，共有峰面積占峰總面積90%以上，非共有峰均為在樣品中含量較少不穩(wěn)定的峰。各共有峰都存在，但峰面積及相對(duì)峰面積卻有差異。因此可通過荷葉HPLC指紋圖譜反映不同品種荷葉內(nèi)在質(zhì)量的差別。

1 Tao B(陶波)，Chen MY(陳幕英)，Li XN(李曉寧).Situation in official study on lotus leaves.Chin J Inf Tradit Chin Med(中醫(yī)藥信息)，2001，18(3):14.

2 Wang FG(王福剛)，Cao J(曹娟)，Liu B(劉斌)，et al.The perspective of pharmacological role and compositions of lotus leaf.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2010，21:2339-2340.

3 Wei CL(魏朝良)，Yu DH(于德紅).Study on flavonoide compounds and mechanism of eliminating radical.Chin Tradit Pat Med(中成藥)，2005，27:239-241.

4 Zhao J(趙駿)，Gao L(高嵐)，Qi ZP(齊召朋).Compare of extraction and lipid-lowering role of alkaloid from lotus leaves.J Tianjin Tradit Chin Med(天津中醫(yī)藥)，2005，22:161-162.

5 Ji LL(紀(jì)麗蓮).Extraction of antibiotic composition from lotus leaves and study on their bacteriostatic activity.Food Sci(食品科學(xué))，1999，8:64-66.

6 Wang LL(王玲玲)，Liu B(劉斌)，Shi RB(石任兵).Study on chemical constituents of folium nelumbinis.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2009，21:416-419.

7 Zhou LX(周蘭香)，Huang AG(黃阿根)，Xie KZ(謝凱舟).Study on testing flavone from lotus leaves by spectrophotometry and HPLC.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2002，33(2):35-37.

8 Fan SY(樊淑彥)，Cao XF(曹曉芳)，Liu SP(劉淑萍).Determining the content of flavone from lotus leaves by colorimetric method.J Hebei Univ Chin Med(河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2004，25:215-217.

9 Xiao GQ(肖桂青)，F(xiàn)ang J(方俊)，Lu XY(盧向陽(yáng))，et al.Microwave assistant extraction of total alkaloids from Lotus Leaves，Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2008，20:918-921，943.