新生隱球菌GXM的純化及其對巨噬細胞甘露糖受體表達調(diào)節(jié)的研究

李平 譚宏月 胡嬋 陳麗華 皇幼明 鐘彬 朱紅梅 溫海

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

新生隱球菌易于感染免疫功能低下人群，如HIV感染、器官移植及血液腫瘤患者等，由于其嗜中樞特性，?？蓪е轮旅缘闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染。隱球菌莢膜是重要的毒力因子，組成成分包括葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖(GXM)、半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)和少量的甘露糖蛋白(MP)等，其中GXM占多糖成分的90%以上，既可以黏附在細胞壁上形成莢膜結(jié)構(gòu)，也可以釋放到培養(yǎng)上清中。GXM可以增強隱球菌抵抗吞噬細胞的吞噬作用，也可以誘導機體產(chǎn)生抑制性細胞因子IL-10、抑制機體產(chǎn)生炎性細胞因子 IL-2、TNF-α 和 IFN-γ等［1-2］，在隱球菌逃逸機體的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)隱球菌能下調(diào)巨噬細胞MR的表達，因此本文詳細介紹了如何從新生隱球菌B3501中分離和純化GXM，并探討了隱球菌GXM對巨噬細胞MR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新生隱球菌采用B3501標準株，由中國醫(yī)學真菌保藏管理中心隱球菌專業(yè)實驗室提供。真菌培養(yǎng)基采用YNB培養(yǎng)基 (YNB粉末6.7 g，葡萄糖5 g，氯霉素200 mg，定容至1 L，過濾除菌)及YPD平板 (酵母抽提物10 g，蛋白胨20 g，氯霉素200 mg，瓊脂15 g，定容至900 mL，高壓滅菌，冷卻至60℃后加入無菌的20%的葡萄糖100 mL制成平板)。C57BL/6J(H-2Kb)小鼠，雌性，6～8周齡，購自上海必凱實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、酵母氮基礎(chǔ)(YNB)購自Sigma，CTAB配制成0.3%的水溶液置常溫備用。酵母抽提物、蛋白胨、氯霉素、瓊脂糖、苯酚、硫酸、無水乙醇、NaCl、葡萄糖、磷酸鈉均為國產(chǎn)分析純試劑，DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B柱購自GE公司，M-PER蛋白抽提試劑、BCA蛋白檢測試劑盒、Western熒光檢測試劑購自Pierce，HRP標記抗羊IgG購自Santa Cruz，羊抗鼠MMR抗體、內(nèi)參抗體兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)抗體購自R＆D公司。

1.3 方法

新生隱球菌B3501培養(yǎng)上清的乙醇沉淀法從平板上挑取一個菌落，接種至1 L YNB培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)3～4 d，9 000 r/min離心收集上清，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，此時會出現(xiàn)奶狀沉淀，搖勻后置4℃過夜。次日于9 000 r/min高速離心收集沉淀，棄上清，沉淀盡量風干。加約18 mL水溶解沉淀(有時需攪拌過夜)，此時形成黏稠溶液，為GXM及GalXM多糖混合物。

多糖濃度的測定 采用苯酚硫酸法測量多糖的含量，首先配制1%的葡萄糖，繪制標準曲線:取6個玻璃管，每管加蒸餾水2 mL，按順序每管相應(yīng)加入 1%的葡萄糖 0、5、10、20、40、80 μL，然后加入新鮮配制的6%的苯酚1 mL，混勻，再迅速加入5 mL濃硫酸(注:加濃硫酸時應(yīng)迅速直接加入玻璃管中，不應(yīng)沿管壁加入)，反應(yīng)過程會釋放大量熱量，可將玻璃管置23℃水浴降溫，20 min后于490 nm測量光密度，繪制標準曲線。同時取待測樣品10、20、40 μL 按相同方法測量光密度值，取平均值測算多糖含量。

CTAB沉淀GXM 常溫時在上述獲得的多糖溶液中加入2 mL 2 mol/L的NaCl(使NaCl終濃度為0.2 mol/L)，然后緩慢加入0.3%的 CTAB，邊加邊攪拌，CTAB用量應(yīng)為多糖含量的3倍，如100 mg多糖溶液應(yīng)加入0.3%的 CTAB 100 mL(=300 mg CTAB)，為確保GXM被完全沉淀，提高效率，實際操作中CTAB用量高于理論值，直至無新沉淀產(chǎn)生為止。9 000 r/min離心收集沉淀，沉淀使用10%乙醇洗一遍，風干，此為 CTABGXM復(fù)合物。然后加12 mL 1 mol/L的NaCl溶解沉淀，再加入2.5倍體積無水乙醇沉淀溶液中的GXM，此時 CTAB仍存留于溶液中，9 000 r/min高速離心 30 min，收集沉淀 (GXM)，用 2 mol/L的NaCl溶解沉淀，溶解需過夜或數(shù)日，可用超聲波短暫超聲，有助于GXM溶解［3］，此時會形成極其黏稠溶液，似甘油。

GXM緩沖液的交換 取GXM溶液加至10KD的透析袋中，密封，將透析袋置于1 mol/L NaCl于4℃透析1 d，再將透析液換成雙蒸水透析1周，每天換液，直至形成清亮的溶液，最后再用PBS透析1 d，將GXM溶液置換成PBS，酚硫酸法測量濃度后存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

DEAE離子交換層析鑒定GXM 離子交換層析之前將GXM緩沖液交換為0.01 mol/L的磷酸鈉 (pH7.1)，然后過DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B柱，用磷酸鈉緩沖液清洗柱子，用0.01 mol/L的磷酸鈉/0.3 mol/L的 NaCl洗脫結(jié)合的 GXM，每1 mL洗脫液使用苯酚硫酸法測量490 nm的OD值，繪制成洗脫峰。

GXM與巨噬細胞共孵育 實驗前4 d給予小鼠腹腔注射硫羥乙酸肉湯2 mL，實驗前1 d脫頸處死小鼠，用含10%胎牛血清的DMEM反復(fù)沖洗腹腔，離心收集細胞，紅細胞較多時使用Tris-NH4Cl破紅處理，計數(shù)，106/孔鋪6孔板，孵箱中培養(yǎng)24 h，輕輕吹打去除懸浮細胞，貼壁細胞即為腹腔巨噬細胞。加入純化的 GXM，使其終濃度為30 μg/mL，陰性對照組加入與GXM同體積的PBS(磷酸鹽緩沖液)，陽性對照組加入200 ng/mL的 LPS(脂多糖)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

Western blot鑒定 培養(yǎng)的巨噬細胞用2 mL PBS(pH7.4)清洗兩遍，加蛋白裂解液于冰上裂解20 min，BCA法測定濃度后調(diào)整蛋白濃度一致行SDS-PAGE電泳，隨后以100 V恒電壓于4℃ 90 min轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h，抗MR一抗室溫孵育2 h，TBST洗膜15 min、3次，HRP標記的抗羊IgG二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜15 min、3次，然后加入ECL化學發(fā)光底物作用1 min，置暗室曝光顯影并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 多糖含量的測定

首先我們用酚硫酸法測量了不同含量的葡萄糖在490 nm的光密度值，縱坐標為糖含量，橫坐標為OD值，繪制了標準曲線 (見圖1)，得到了多糖含量的計算方程:Y=690.6X-68.91，Y代表多糖含量(μg)，X代表OD值。待測樣品3管，分別測其OD 值為 0.159，0.227，0.351，換算濃度分別為 4.09，4.39，4.34 mg/mL，取平均值為4.27 mg/mL，多糖溶液體積為18 mL，表明我們從1 L培養(yǎng)上清中獲得了GXM及GalXM多糖混合物77 mg。

2.2 GXM含量的測定

多糖經(jīng)CTAB特異性沉淀GXM，再使用乙醇沉淀CTAB-GXM溶液中的GXM，透析后最終獲得11 mL GXM 溶液，同樣取 3 管 (40 μL、80 μL、160 μL樣品)使用酚硫酸法測量其濃度，分別為2.82、3.08、3.1 mg/mL，取平均值為 3 mg/mL，獲得了約33 mg的GXM，得率為42.9%(33/77)與Cherniak R等人報道一致［3］。但Wozniak等報道每升培養(yǎng)上清中可獲得高至200 mg的GXM［4］，我們的純化效率稍微有點低，這可能是因為乙醇沉淀的時候沒有加醋酸鈉，在醋酸鈉存在的情況下可以增加乙醇沉淀多糖的效率。

2.3 離子交換層析鑒定GXM純度

根據(jù)文獻報道［3］，我們使用DEAE離子交換層析初步鑒定了GXM的純度，由圖2可見，GXM洗脫后表現(xiàn)為單一的洗脫峰，表明所純化的GXM的純度是比較高的，我們成功獲得了高純度的GXM，為下一步研究打下了基礎(chǔ)。

2.4 GXM不影響巨噬細胞甘露糖受體MR的表達

接下來我們通過western blot觀察了GXM對巨噬細胞MR表達的影響，我們發(fā)現(xiàn)，30 μg/mL的GXM處理巨噬細胞72 h后，MR的表達在蛋白水平與PBS處理的空白對照組相比無明顯差異，200 ng/mL的LPS處理72 h的陽性對照組MR的表達明顯下降(見圖3)，表明MR的表達不受GXM的調(diào)節(jié)。

圖1 酚硫酸法測量碳水化合物含量曲線圖 圖2 離子交換層析鑒定GXM純度曲線圖 圖3 Western blot鑒定GXM對巨噬細胞MR的表達的影響Fig.1 Measurement of polysaccharide concentration by phenol sulfuric method Fig.2 Identification of GXM by Ion-exchange chromatography Fig.3 Western blot identification the role of GXM in regulating MR expression in macrophages，GAPDH was used as the reference gene

3 討 論

GXM的分離和純化在國外多個實驗室均有報道，一般均采用乙醇及CTAB沉淀法，但是國內(nèi)尚缺乏該方面的研究報道。Cherniak［3］等人報道采用高壓或福爾馬林處理隱球菌可提高GXM的產(chǎn)量，同時也報道了單純乙醇沉淀多糖的效率是最低的，丙酮與乙醇聯(lián)合使用可以明顯提高純化效率。另使用乙醇及醋酸鈣沉淀法可獲得最大產(chǎn)量，但因為醋酸鈣易形成沉淀，影響后續(xù)實驗的進行。我們也曾采用過Wozniak［4］等人報道的方法純化GXM，即乙醇沉淀的時候同時加用醋酸鈉，沉淀的多糖含量明顯高于單純乙醇沉淀法，但沉淀很難溶解，一方面是因為GXM-GalXM混合物本身難溶，另一方面是由于醋酸鈉在乙醇沉淀的時候也容易形成沉淀，此時往往需要加冰醋酸溶解沉淀。對于一般實驗而言，不使用醋酸鈉也能達到所需要的產(chǎn)量。另外，CTAB在低溫的時候難于溶解，因此實驗過程中盡量控制在室溫，避免CTAB低溫形成沉淀影響最終實驗結(jié)果。如果透析完后GXM渾濁，表明CTAB沒有完全去除，此時需用1 mol/L的NaCl重新透析，以便將殘余的CTAB清除干凈。若需要做免疫學相關(guān)實驗，尚需要測量GXM的內(nèi)毒素含量，實驗過程中為了防止內(nèi)毒素污染，應(yīng)盡量使用一次性實驗器材，使用超純無內(nèi)毒素水。

GXM可從新生隱球菌和格特隱球菌(血清型A-D)中分離純化，是隱球菌莢膜的重要組成部分，是毒性因子之一，除了抗吞噬、誘導免疫抑制外，在隱球菌腦膜炎發(fā)病中，有莢膜株比無莢膜株可以更快地穿過腦血管內(nèi)皮細胞，并且在隱球菌穿過血腦屏障后，莢膜多糖的大小和結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化［5］，表明莢膜在隱球菌病發(fā)病中具有多方面的功能。GXM還可以通過Fas配體誘導巨噬細胞凋亡［6］，可以抑制白細胞的遷移［7］、損害粒細胞抗隱球菌活性［8］，也可以誘導或抑制機體產(chǎn)生多種細胞因子，其中有的報道GXM能促進TNF-α的產(chǎn)生［9］，也有報道 GXM 能抑制 TNF-α 的產(chǎn)生［2］。因此有關(guān)GXM的生物學功能尚未完全明確，需進一步研究。

甘露糖受體MR也叫CD206，是一大小為175 KD的跨膜糖蛋白，不僅表達于巨噬細胞，還表達在未成熟樹突狀細胞 (dendriticcells，DCs)、視網(wǎng)膜上皮細胞及肝臟內(nèi)皮細胞等［10］。DCs通過MR識別新生隱球菌甘露糖蛋白 (mannoprotein，MP)，內(nèi)吞并遞呈甘露糖蛋白抗原給T細胞，誘發(fā)機體的抗感染免疫［11］。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)新生隱球菌能下調(diào)DCs和巨噬細胞MR的表達，鑒于MR在抗隱球菌感染免疫中的重要作用，我們推測隱球菌下調(diào)MR的表達有可能是其逃逸機體免疫應(yīng)答的一個新機制［12］。因此我們觀察了新生隱球菌GXM對巨噬細胞甘露糖受體MR的表達影響。實驗結(jié)果表明GXM不能下調(diào)MR的表達，說明隱球菌可能是通過其他莢膜或菌體成分諸如甘露糖蛋白等下調(diào)MR的表達的。關(guān)于隱球菌下調(diào)MR表達的具體機制尚需進一步研究。

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