反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4與白念珠菌耐藥性的研究

苗琦 張石群 曹永兵 姜遠(yuǎn)英

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433)

隨著癌癥放療、化療、器官移植、艾滋病患者的增加，廣譜抗生素、免疫抑制劑的長期廣泛應(yīng)用，深部真菌感染已逐漸成為一種常見病、多發(fā)病，并已成為這些免疫功能低下人群死亡的主要原因。在深部真菌感染中，念珠菌是最常見的病原菌［1］，而且由于臨床可用的抗真菌藥物有限，真菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，成為臨床治療失敗的主要原因。

在玉米、小麥、小鼠、人類的基因組中，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分別占78%、68%、52%和45%，通常情況下被嚴(yán)格控制［2］。研究表明，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在很大程度上是侵略性的，會導(dǎo)致基因的失活和基組的不穩(wěn)定因組的組分，進(jìn)化成啟動子、增強(qiáng)子或者沉默子，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)［3］。所有的真核生物中的一個普遍生物學(xué)現(xiàn)像，就是生物和非生物脅迫可激活反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活性，介導(dǎo)物種的快速適應(yīng)。例如植物在環(huán)境脅迫情況下，可激活反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，從而調(diào)節(jié)植物抗逆相關(guān)基因的表達(dá)。因此轉(zhuǎn)座是植物自我保護(hù)的一種反應(yīng)［4］。細(xì)菌的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以介導(dǎo)耐藥性的形成，并通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移和克隆播散方式傳播多種耐藥基因，是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥菌株增多的重要因素。例如轉(zhuǎn)座子Tn除了攜帶與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因外，還攜帶有耐藥基因的一段可移動DNA序列。Tn在同一細(xì)胞的染色體與質(zhì)粒間跳躍移動，可使耐藥基因大量增加，產(chǎn)生耐藥。Tn916樣接合轉(zhuǎn)座子就是散播tetM基因介導(dǎo)的四環(huán)素、米諾環(huán)素耐藥的重要載體［5］;復(fù)合型轉(zhuǎn)座子 Tn5385則介導(dǎo)了鏈霉素、四環(huán)素、慶大霉素、紅霉素等耐藥性［6］。而釀酒酵母的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1在通常情況下也是沉默的，但在脅迫條件下可被激活并轉(zhuǎn)座。這些脅迫包括:紫外照射、X-光輻射、氮饑餓、低溫刺激［7］以及腺嘌呤饑餓［8］。

本研究目的在于研究高溫誘導(dǎo)白念珠菌中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4的表達(dá)情況與其耐藥性產(chǎn)生的關(guān)系。采用spot assay考察高溫誘導(dǎo)菌株對藥物的耐受能力，并用實(shí)時定量PCR方法檢測誘導(dǎo)菌株中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4的表達(dá)水平與氟康唑耐藥的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗菌株與藥敏檢測

白念珠菌(Candida albicans)ATCC-10231由第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院菌種保存中心饋贈。參照美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的M27-A微量液基稀釋法測定實(shí)驗菌株對氟康唑的敏感性。

1.2 培養(yǎng)基

沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA):蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，調(diào)整pH至7.0，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存。YEPD培養(yǎng)液:酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存。

1.3 主要試劑

30%過氧化氫 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，咪康唑 (miconazole，MCZ，Sigma)，二甲基亞砜 (dimetuyl sulfoxide，DMSO)為國產(chǎn)分析純，用前重蒸。真菌RNAout試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)，柱式RNA clean試劑盒 (北京天恩澤基因科技有限公司)，實(shí)時定量PCR所用試劑均購自TaKaRa公司:DNaseI(RNase Free)(CodeNo.D2215)，Reverse Transcriptase XL(AMV)(CodeNo.D2620)，Ribonuclease Inhibitor(CodeNo.D2310A)，Random Primer(6mer)(CodeNo.D3801)，dNTP Mixture(CodeNo.D4030A);SYBR-GreenI Premix Ex Taq(CodeNo.DRR041);引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 儀器與裝置

T-gradient PCR儀、熒光定量real-time PCR儀(Bio-Rad);Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測儀 (Labsystems);MJX型智能霉菌培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠制造);Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf);紫外分光光度計 (Unico UV-2000 Spectrophotometer)。

1.5 高溫誘導(dǎo)子代的獲取

在YEPD固體培養(yǎng)基中平行選取親本菌株ATCC-10231中的三個單克隆，分別轉(zhuǎn)移到1 mL新鮮的YEPD培養(yǎng)液中于37℃培養(yǎng)16 h，以后每次傳代均從上代培養(yǎng)液中取10 μL轉(zhuǎn)移到1 mL新鮮的YEPD培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)得到子代，共傳24代得到子代ATCC-10231-37℃。

1.6 spot assay實(shí)驗

首先澆鑄含藥的SDA平板:將配置的SDA高壓滅菌 (121℃，15 min)，待培養(yǎng)基冷卻至不燙手后加入藥物，使最終溶液的濃度達(dá)到咪康唑(MCZ)2 μg/mL，H2O25 mmol/L，徹底混勻后倒入無菌的平皿上，靜至冷卻。將白念珠菌 ATCC-10231和ATCC-10231-37℃在YEPD培養(yǎng)液中分別連續(xù)2次活化16 h達(dá)到對數(shù)生長期后期，3 000×g離心5 min用1 mol/mLPBS洗2次，血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，用YEPD培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×107cells/mL，10倍倍比稀釋得到5個密度梯度，即1×107cells/mL，1 ×106cells/mL，1 ×105cells/mL，1 ×104cells/mL，1 ×103cells/mL，取4 μL 菌液點(diǎn)在含藥平板上，于30℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌在平板上的生長情況并拍照記錄實(shí)驗結(jié)果。

1.7 生長曲線實(shí)驗

將白念珠菌ATCC-10231和ATCC-10231-37℃以1∶100接種至1 mL YEPD培養(yǎng)液，于30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，活化兩次，使真菌處于指數(shù)生長期后期。取該菌液至YEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化16 h后，以紫外分光光度計600 nm測菌液OD值，以YEPD培養(yǎng)液稀釋并調(diào)整菌液濃度至OD值為0.1。分別于100 mL上述菌液中加入氟康唑16 g/mL，空白對照加入相同體積的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5%。于30℃孵箱中，以200 r/min 振蕩培養(yǎng)，分別于 0、2、4、6、8、20、24 和30 h，各樣品分別取 100 μL 液體，以紫外分光光度計600 nm測菌液OD值，以O(shè)D值確定其菌生長濃度的變化。

1.8 實(shí)時定量PCR對反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4中ORF表達(dá)水平的考察

采用真菌RNAout試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)進(jìn)行總RNA抽提，用DNA酶去除基因組DNA污染后利用紫外分光光度儀檢測RNA的純度和濃度，使其OD260/OD280值應(yīng)大于1.8小于2.1，并對RNA進(jìn)行定量。

RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 按體系配制反轉(zhuǎn)錄混合反應(yīng)液 5 ×PrimeScript Buffer(4 μL)、Enzyme MixI(1 μL)、Oligo(dT)Primer(1 μL)、Random 6 mers(1 μL)、RNA(1 μg)、RNase Free dH2O(終體積為20 μL)?；靹蚝蟀慈缦聴l件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃暫存。反應(yīng)液配制在冰上操作，所用槍頭及PCR管均在實(shí)驗前用焦碳酸二乙酯(DEPC水)進(jìn)行去RNA酶處理。

RT-PCR反應(yīng) 目的基因引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列見表1。按照以下體系冰上配置 RT-PCR反應(yīng)液:2×SYBR Premix Ex Taq II(10 μL)、Primer FWD(0.5 μL)、Primer RV(0.5 μL)、模板 cDNA(2 μL)、ddH2O(7 μL)?；靹蚝蟀慈缦聴l件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng):95℃ 1 min;95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。記錄反應(yīng)終止循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct)，用內(nèi)參18SrRNA的Ct值校正目的基因Ct值，得到△Ct，比較實(shí)驗組和對照組的△Ct得到△△Ct，基因表達(dá)量比值 (實(shí)驗組/對照組)=2-△△Ct。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)時定量RT-PCR獲得的是每個基因的Ct值，通過18SrRNA內(nèi)參校正獲得△Ct［△Ct=Ct(目的基因)-Ct(18SrRNA)］，再通過與參照菌株ATCC-10231相比獲得△△Ct［△△Ct=△Ct(實(shí)驗菌株)-△Ct(參照菌株)］，用Ratio值 (實(shí)驗菌株與ATCC-10231菌株相比基因表達(dá)情況)表示基因表達(dá)水平，Ratio值=2-△△Ct，以Ratio值＞2代表與ATCC-10231基因表達(dá)情況相比，基因發(fā)生高表達(dá)。實(shí)時定量PCR進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗，所得Ratio以(±s)表示，統(tǒng)計反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4中ORF高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性實(shí)驗

通過微量液基稀釋法發(fā)現(xiàn):親本菌 ATCC-10231 對氟康唑的 MIC80=0.5 μg/mL，高溫誘導(dǎo)菌株 ATCC-10231-37℃的 MIC80≤0.125 μg/mL。

2.2 spot assay實(shí)驗

經(jīng)過高溫連續(xù)誘導(dǎo)的白念珠菌對氟康唑的耐受能力明顯降低。與親本菌ATCC-10231相比，長期高溫刺激后的ATCC-10231-37℃對咪康唑 (2 μg/mL)和H2O2(5 mmol/L)都更加敏感，而在空白YEPD培養(yǎng)基上生長狀況沒有差別(見圖1)。

2.3 YEPD培養(yǎng)液中生長曲線實(shí)驗

結(jié)果顯示16 μg/mL氟康唑24 h內(nèi)對ATCC-10231-37℃的抑制作用明顯高于對ATCC-10231的抑制作用。進(jìn)一步證明與親本菌ATCC-10231相比，長期高溫刺激后的ATCC-10231-37℃對藥物變得更加敏感 (見圖2)。

2.4 TCA4 中 Orf19.2668 和 Orf19.2669 的表達(dá)水平測定

根據(jù)實(shí)時定量RT-PCR實(shí)驗獲得Ct值和計算獲得的Ratio值:高溫誘導(dǎo)菌株ATCC-10231-37℃中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4的開放閱讀框Orf19.2668和Orf9.2669與親本菌ATCC-10231相比均發(fā)生高表達(dá) (見圖3)。

3 討 論

在深部真菌感染中，白念珠菌易于感染，難以防治的關(guān)鍵原因是其具有高適應(yīng)性的特點(diǎn)。所有真核生物中的一個普遍生物學(xué)現(xiàn)象就是生物和非生物脅迫可激活反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活性，介導(dǎo)物種的快速適應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報道，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA1［9］，TCA2［10］，TCA5［11］以及非 LTR 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 ZORRO元件 (ZORRO2和ZORRO3)［12］都是具有轉(zhuǎn)座活性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。從生物進(jìn)化角度來說，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以動態(tài)改變基因組結(jié)構(gòu)及功能，會使細(xì)胞積累一些變異，從而改變細(xì)胞在新生存環(huán)境中的存活能力。

圖1 點(diǎn)板實(shí)驗結(jié)果 圖2 生長曲線實(shí)驗結(jié)果 圖3 ATCC-10231-37℃與ATCC-10231中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4中兩個ORF的表達(dá)情況Fig.1 Results of spot assay.Each strain was grown from D600=0.1 until D600=0.1=1.0，4 μL of each dilution was spotted onto YEPD-agar plates supplemented with drugs.Plate were incubated for 48 h at 30℃ Fig.2 Growth curves of fluconazole(FLC)against C.albicans ATCC-10231 and ATCC-10231-37℃ Fig.3 Relative expression values of retrotransposon TCA4＇s ORFs(Orf19.2668 or Orf19.2669)in the high temperature induced strains and the wild type strsin.18SrRNA was used as the internal control.n=3，珋x ± s

本研究通過微量液基稀釋法、spot assay實(shí)驗以及對氟康唑的生長曲線實(shí)驗均發(fā)現(xiàn)與親本菌ATCC-10231相比，高溫長期誘導(dǎo)菌株 ATCC-10231-37℃對抗真菌藥物敏感性明顯降低，說明高溫是調(diào)控白念珠菌對環(huán)境脅迫產(chǎn)生適應(yīng)性，介導(dǎo)菌株對藥物敏感性改變的原因之一。在此基礎(chǔ)上，采用實(shí)時定量RT-PCR方法檢測白念珠菌敏感株ATCC-10231及其誘導(dǎo)菌株ATCC-10231-37℃中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4中兩個具有編碼蛋白功能的開放閱讀框Orf19.2668和Orf19.2669的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ATCC-10231-37℃中TCA4的兩個開放閱讀框表達(dá)量相對于親本菌的有明顯升高，說明高溫刺激改變了白念珠菌反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4的活性，其RNA拷貝數(shù)的顯著性差異證明了TCA4是依賴于溫度的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。Holton等［10］的研究表明，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA2在高溫誘導(dǎo)的條件下轉(zhuǎn)座發(fā)生率明顯升高，表達(dá)量升高。而與此相反，TCA1［9］卻是在低溫誘導(dǎo)的條件下轉(zhuǎn)座發(fā)生率更高。由此我們推測，生存溫度改變是導(dǎo)致TCA4轉(zhuǎn)座激活，進(jìn)而造成ATCC-10231-37℃較親本菌對抗真菌藥物敏感的因素之一。

因為白念珠菌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生是多機(jī)制共同作用的結(jié)果，包括外排泵蛋白高表達(dá)，藥物作用靶酶高表達(dá)或變異，生物被膜產(chǎn)生等，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座激活也是白念珠菌耐藥機(jī)制之一。本研究探討反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對白念珠菌耐藥性形成的調(diào)控作用及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)白念珠菌ATCC-10231在高溫的刺激下通過改變反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TCA4的活性來調(diào)控白念珠菌對氟康唑的適應(yīng)性。不僅有助于闡明白念珠菌耐藥性形成新機(jī)制，也為進(jìn)一步研究反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對白念珠菌其他適應(yīng)性的調(diào)控作用，以及研究其在白念珠菌中更廣泛的生物活性奠定工作基礎(chǔ)。

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