金龜子綠僵菌CQMa128新制劑對花生蠐螬的田間防控效果

殷幼平， 申劍飛， 時玉娟， 劉美昌， 邵長文， 王中康＊

（1.重慶大學生物工程學院，重慶市殺蟲真菌農(nóng)藥工程技術中心，重慶 400030；2.山東省日照市植保站，日照 276800）

金龜子屬鞘翅目金龜總科（Scarabaeoidea），其幼蟲俗稱蠐螬，是一類重要的地下害蟲。主要為害植物的地下部分，具有一定的隱蔽性且分布廣泛，其危害性在地下害蟲中居首位，是一類世界性難防的地下害蟲［1－4］。目前危害我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的花生蠐螬主要是銅綠異麗金龜（Anomala corpulenta），暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）和華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）。近年來，蠐螬在我國主要花生產(chǎn)區(qū)山東、河南等省，發(fā)生面積擴大，危害加重。傳統(tǒng)使用的高毒農(nóng)藥特丁硫磷、呋喃丹等因環(huán)境污染嚴重已被禁用，而替代化學農(nóng)藥辛硫磷、毒死蜱等用于防治花生蠐螬，亦存在土壤、水體污染問題和殘留問題［3］。金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類重要的生防真菌，在生產(chǎn)上已得到廣泛應用，全世界約有200多種昆蟲能被綠僵菌的不同菌株感染致死［5－6，21］。國外已有綠僵菌登記產(chǎn)品防治地下害蟲的報道［7－9］，國內(nèi)目前尚無蠐螬綠僵菌商業(yè)化制劑登記的報道。重慶大學于2007年從花生地蠐螬僵蟲和土壤中分離得到一株高效抗逆的金龜子綠僵菌，編號CQMa128。依據(jù)形態(tài)學特征和分子鑒定序列比對結(jié)果將其鑒定為金龜子綠僵菌大孢變種（Metarhizium anisopliae var.majus）。室內(nèi)生測結(jié)果表明其對花生主要蠐螬種類銅綠異麗金龜、暗黑鰓金龜和華北大黑鰓金龜?shù)挠紫x等都具有較高的致病力［23］。本文研究了重慶大學研制的綠僵菌CQMa128微粒劑和乳粉劑對田間花生蠐螬的防治效果、使用技術以及對蠐螬主要天敵昆蟲臀鉤土蜂［10－12］（Tiphiidae）的影響，以期為開發(fā)安全有效的綠僵菌生物制劑奠定基礎并提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗地條件

田間試驗設在山東省日照市三莊鎮(zhèn)“千畝國家無公害花生示范生產(chǎn)基地”（E119°27′，N36°47′）。前作均為花生，常年蠐螬發(fā)生嚴重，蠐螬蟲口基數(shù)15～26頭／m2。試驗地花生品種為主栽大花生抗病優(yōu)良品種‘日花1號’。花生蠐螬主要為銅綠異麗金龜和暗黑鰓金龜幼蟲。試驗區(qū)土壤為沙質(zhì)土，肥力中等，pH為5.5～6.5。

1.2 供試藥劑

10億孢子／g綠僵菌CQMa128微粒劑［29］（農(nóng)藥劑型代碼：MG）；100億孢子／g綠僵菌CQMa128乳粉劑［30－31］（農(nóng)藥劑型代碼：EP）；上述供試產(chǎn)品全部由重慶大學生物工程學院研制，委托重慶重大生物技術發(fā)展有限公司生產(chǎn)。對照化學藥劑：15%毒死蜱顆粒劑（山東聯(lián)合農(nóng)藥有限公司）；48%毒死蜱乳油（山東聯(lián)合農(nóng)藥有限公司）。毒死蜱［24］是一種高效、低毒、低殘留的有機磷含氮雜環(huán)類殺蟲殺螨劑，對地下害蟲具有較好的防治效果?？瞻讓φ諡椴皇┧?，微粒劑以相同數(shù)量的沙土替代；乳粉劑以相同數(shù)量的清水替代。

1.3 田間試驗處理及方法

（1）花生播種期（2009年4月及2010年4月施藥），采用10億孢子／g綠僵菌CQMa128緩釋型微粒劑對花生田中2008年和2009年越冬的3齡蠐螬老熟幼蟲進行防控，施藥劑量分別為225、300、375kg／hm2，采用拌土方式進行施藥處理，并設15%毒死蜱顆粒劑15kg／hm2化學藥劑對照和沙土空白對照，定期調(diào)查田間蟲口數(shù)量變化。整個試驗共設20個小區(qū)，分為5個區(qū)組。每小區(qū)設1個處理，每個區(qū)組含5個不同處理的小區(qū)（相當于每個處理4次重復）。區(qū)組內(nèi)的小區(qū)隨機排列，小區(qū)面積134m2，各小區(qū)間設2m以上的保護行，以防小區(qū)間互相干擾，所有試驗小區(qū)間的栽培管理條件均基本保持一致。

（2）花生幼果期是花生蠐螬為害的高峰期，有必要在微粒劑施藥的基礎上進行下一輪防治。分別于2009年7月及2010年7月采用100億孢子／g綠僵菌CQMa128乳粉劑對當年的1～2齡蠐螬進行防控，施藥劑量為2.5、5、7.5kg／hm2，采用灌墩方式進行施藥處理，同時設化學藥劑對照48%毒死蜱乳油4.5L／hm2和清水空白對照。定期調(diào)查田間蟲口數(shù)量變化。試驗小區(qū)排列設計和試驗條件同微粒劑施藥處理。施藥時間選擇在傍晚17：00－19：00進行［13］，以減輕夏日陽光紫外線對綠僵菌孢子的殺傷。

（3）在綠僵菌CQMa128微粒劑防治試驗中，分別于施藥后7、14、21、28d，調(diào)查各處理區(qū)每200株花生植株中花生蠐螬寄生性天敵臀鉤土蜂蛹的數(shù)量變化。在綠僵菌CQMa128乳粉劑的防治試驗中，分別于施藥后7、14、21、28d，調(diào)查各處理區(qū)每200株花生植株中臀鉤土蜂成蟲數(shù)量，觀察綠僵菌CQMa128制劑的施用是否對臀鉤土蜂的種群存活變化存在影響。

1.4 田間防效調(diào)查方法

在綠僵菌微粒劑防控試驗中，分別于施藥后10、20、30、40、50d進行防治效果調(diào)查。在綠僵菌乳粉劑防控試驗中，分別于施藥后10、15、20、25、30d進行防治效果調(diào)查。根據(jù)各處理小區(qū)的蟲口減退率計算出各處理的平均校正防效，并在花生成熟收獲期調(diào)查各處理的保果效果，測算出平均保果率和平均花生產(chǎn)量鮮重。

調(diào)查方法為在每小區(qū)內(nèi)采取平行跳躍式5點取樣法，每點40墩花生，重復3次，調(diào)查總面積為9m2，根據(jù)調(diào)查結(jié)果計算各處理的蟲口減退率、平均校正防治效果及保果率［15－16］。計算 公式［25］如下：蟲口減 退率＝（處理區(qū)施藥前蟲數(shù)－處理區(qū)施藥后蟲數(shù)）∕處理區(qū)施藥前蟲數(shù)×100%；校正防治效果＝（處理區(qū)蟲口減退率－對照區(qū)蟲口減退率）∕（100%－對照區(qū)蟲口減退率）×100%；保果率＝（對照區(qū)被害果率－處理區(qū)被害果率）／對照區(qū)被害果率×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

采用Microsoft Excel 2003軟件和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（2008版）對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理［17］，并用Duncan新復極差法對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生播種期10億孢子／g CQMa128微粒劑的防治效果

在綠僵菌CQMa128微粒劑施藥后進行田間藥效調(diào)查，最早可在施藥后20d左右發(fā)現(xiàn)有被侵染的蠐螬僵蟲出現(xiàn)，表明綠僵菌CQMa128能在當?shù)赝寥乐杏行Т婊畈⑶秩鞠擉┲滤馈Ｇ以诿總€防治效果調(diào)查時間段（10、20、30、40、50d）調(diào)查沙土空白對照的蟲口變化情況，其蟲口減退率均小于3%。連續(xù)2年（2009—2010年）的田間試驗結(jié)果（表1）表明，CQMa128微粒劑施藥后的各處理均能對田間3齡花生蠐螬產(chǎn)生持續(xù)的防治效果。高劑量處理區(qū)（375kg／hm2）在施藥后30～40d內(nèi)，其平均校正防效達到最大值（75.58%～80.03%），且與同時期化防對照處理區(qū)（15%毒死蜱顆粒劑）的平均校正防效83.61%～87.96%之間沒有顯著性差異（p≥0.05），說明高劑量（375kg／hm2）綠僵菌CQMa128緩釋性微粒劑在施藥后30～40d對田間3齡花生蠐螬的防治效果最好。微粒劑施藥50d后，各處理的平均校正防效均有下降趨勢，這是因為此時接近金龜子產(chǎn)卵期，田間花生蠐螬基數(shù)開始上升，所以有必要花生幼果期對田間1～2齡的蠐螬進行二次防控，確?；ㄉa(chǎn)量和品質(zhì)。

表1 金龜子綠僵菌CQMa128微粒劑的田間平均校正防效

2.2 花生幼果期100億孢子／g CQMa128乳粉劑的防治效果

每年6－7月間的花生幼果期是田間金龜子成蟲產(chǎn)卵的高峰期，此時金龜子成蟲集中于花生根部土層中產(chǎn)卵，致使田間各處理中1～2齡蠐螬數(shù)量大幅增加，并集中為害花生幼果，因此幼果期是藥劑防治花生蠐螬的關鍵時期［22］。在綠僵菌CQMa128乳粉劑施藥后進行田間藥效調(diào)查，最早可在施藥后10d左右發(fā)現(xiàn)有被侵染的蠐螬僵蟲出現(xiàn)，表明乳粉劑對田間花生蠐螬的侵染效果較好。且在每個防治效果調(diào)查時間段（10、15、20、25、30d）調(diào)查清水空白對照的蟲口變化情況，其蟲口減退率均小于1%。連續(xù)2年（2009－2010年）的試驗結(jié)果（表2）表明，CQMa128乳粉劑施藥后能產(chǎn)生持續(xù)的侵染效果，各處理均能對田間1～2齡花生蠐螬產(chǎn)生一定的防治效果。其中高劑量處理區(qū)（7.5kg／hm2），在施藥后15～20d內(nèi)，其平均校正防效就達到最大值（77.59%～86.46%），且與同時期化防對照處理區(qū)（48%毒死蜱乳油）的平均校正防效87.65%～92.37%之間沒有顯著性差異（p≥0.05）。高劑量處理區(qū)（7.5kg／hm2）在施藥30d后其最終防效保持在80%以上（表2），表明高劑量綠僵菌CQMa128乳粉劑在施藥后30～40d對田間1～2齡花生蠐螬的防治效果最好，能夠有效減輕田間蠐螬對花生幼果的危害。

2.3 保果率和花生產(chǎn)量鮮重

在花生成熟收獲時節(jié)，對各混合處理小區(qū)（微粒劑和乳粉劑先后施藥，高、中、低3個劑量處理）的花生正常果數(shù)和被害果數(shù)進行統(tǒng)計調(diào)查，計算出各處理的平均保果率（表3）。同時對各處理花生產(chǎn)量鮮重進行測定。連續(xù)2年（2009－2010年）的試驗結(jié)果表明，在高劑量的綠僵菌CQMa128微粒劑（375kg／hm2）和乳粉劑（7.5kg／hm2）混合處理區(qū)中，平均保果率能達到85.76%～87.13%，保果效果與化防對照相當（p≥0.05），保果效果顯著。花生產(chǎn)量鮮重測定結(jié)果表明，高劑量的綠僵菌CQMa128微粒劑（375kg／hm2）和乳粉劑（7.5kg／hm2）處理區(qū)中花生產(chǎn)量鮮重比空白對照處理區(qū)平均高出832.5～916.4kg／hm2，增產(chǎn)效果明顯，顯著減輕了花生產(chǎn)量的損失（表3）。

表3 不同處理下的平均保果率和花生產(chǎn)量鮮重

2.4 綠僵菌生防制劑對蠐螬天敵－臀鉤土蜂的影響

在10億孢子／g綠僵菌CQMa128微粒劑施藥后每隔7d，連續(xù)4周，分別調(diào)查各處理區(qū)中臀鉤土蜂蛹的存活數(shù)量。綜合連續(xù)2年（2009－2010年）的調(diào)查結(jié)果，得出3個不同處理區(qū)域中臀鉤土蜂蛹在各個處理中的平均分布情況（圖1）。結(jié)果表明，存活的臀鉤土蜂蛹數(shù)量在10億孢子／克綠僵菌CQMa128微粒劑處理區(qū)域與空白對照之間沒有顯著差異（p≥0.05），大致平均數(shù)量為8～10頭／200株花生。而15%毒死蜱顆粒劑處理區(qū)的臀鉤土蜂蛹數(shù)量呈顯著減少趨勢，臀鉤土蜂蛹存活率下降60%～70%（圖1）。

在100億孢子／g綠僵菌CQMa128乳粉劑施藥后每隔7d，連續(xù)4周，分別調(diào)查各處理區(qū)臀鉤土蜂成蟲的存活數(shù)量變化情況。綜合連續(xù)2年（2009－2010年）的調(diào)查結(jié)果，得出3個不同處理區(qū)域中臀鉤土蜂成蟲平均分布情況（圖2）。結(jié)果表明，存活的臀鉤土蜂成蟲數(shù)量分布在100億孢子／克綠僵菌CQMa128乳粉劑處理區(qū)域與空白對照之間沒有顯著差異（p≥0.05），大致平均數(shù)量為14～16頭／200株花生。而48%毒死蜱乳油處理區(qū)臀鉤土蜂成蟲數(shù)量呈顯著減少趨勢，臀鉤土蜂成蟲存活率下降50%～60%（圖2）。

3 討論

金龜子綠僵菌［21］（Metarhizium anisopliae）寄主廣泛，能寄生直翅目、膜翅目、同翅目、雙翅目、鱗翅目、鞘翅目以及半翅目等7個目、42個科、約200余種昆蟲、線蟲及螨類。在對地下害蟲的防治應用方面，尤其對蠐螬類的致病作用一直是綠僵菌高效殺蟲菌株篩選的重要內(nèi)容［17－21］。目前，國內(nèi)已有利用綠僵菌防治蠐螬的報道［25－27］，但是利用綠僵菌商業(yè)化制劑對蠐螬進行田間大規(guī)模防控方面國內(nèi)尚無相關研究報道。

本研究連續(xù)2年（2009－2010年）采用金龜子綠僵菌CQMa128新制劑對花生蠐螬進行綜合防控，取得了良好的田間防治效果，為今后綠僵菌新制劑在田間大面積推廣應用提供了試驗基礎。研究結(jié)果表明在花生播種期（4－5月），采用10億孢子／g綠僵菌CQMa128微粒劑（施藥量為375kg／hm2）拌土施藥，可以對花生田間上一年越冬的3齡花生蠐螬老熟幼蟲進行有效防治；在花生幼果期（6－7月）采用100億孢子／g綠僵菌CQMa128乳粉劑（施藥量為7.5kg／hm2）灌墩施藥，可以有效防治此時田間盛發(fā)的1～2齡花生蠐螬。田間試驗結(jié)果充分驗證了在花生作物生長的不同時期采取以上綜合防治方法，可以顯著減輕蠐螬對花生植株生長的危害以及花生果莢產(chǎn)量的損失。

本研究證實了金龜子綠僵菌CQMa128對田間花生蠐螬的主要天敵鰓金龜臀鉤土蜂（Tiphia phyllophaga）沒有毒害作用，故在實際防控中可結(jié)合保護利用蠐螬天敵并采用其他生物防治的手段來綜合防治花生田蠐螬，實現(xiàn)不同生防措施的有機結(jié)合與集成應用，達到降低農(nóng)藥殘留、環(huán)境康復的綠色控害目的。例如可以在花生大田周圍安置頻振式殺蟲燈，誘殺金龜子成蟲，以減少其產(chǎn)卵量；在田間種植對金龜子有毒的蜜源植物（紅麻，蓖麻）［22］等。此外，綠僵菌的施用可能會對植物生長具有一定的促進作用，Kabaluk和 Ericsson［28］在利用綠僵菌防治嚴重為害玉米的歐洲金針蟲時，發(fā)現(xiàn)綠僵菌的施用對于玉米根系營養(yǎng)器官的生長以及產(chǎn)量都具有促進作用。如何提高綠僵菌新制劑的田間綜合防治效果以及綠僵菌的施用是否會對花生的生長具有相應的促進作用等科學問題還有待進一步深入研究。

［1］ 王榮燕，宋健，馮書亮，等.銅綠麗金龜?shù)氖覂?nèi)人工飼養(yǎng)［J］.昆蟲知識，2007，50（1）：20－24.

［2］ 魏鴻鈞，黃文琴.中國地下害蟲研究概述［J］.昆蟲知識，1992，29（3）：168－170.

［3］ 姚慶學，張勇，丁巖.金龜子防治研究的回顧和展望［J］.東北林業(yè)大學學報，2003，31（1）：64－66.

［4］ Anitha V，Rogers D J，Wightman J，et al.Distribution and abundance of white grubs （Coleoptera：Scarabaeidae）on groundnut in southern India［J］.Crop Protection，2006，25：732－740.

［5］ Peng G X，Wang Z K，Yin Y P，et al.Field trials of Metarhizium anisopliae var.acridum （Ascomycota：Hypocreales）against oriental migratory locusts，Locusta migratoria manilensis（Meyen）in Northern China［J］.Crop Protection，2008，27：1244－1250.

［6］ Dong Changjin，Zhang Jiamin，Chen Wuguo，et al.Characterization of a newly discovered China variety of Metarhizium anisopliae （M.anisopliae var.dcjhyium）for virulence to termites，isoenzyme，and phylogenic analysis［J］.Microbiological Research，2007，162：53－61

［7］ 金玉榮，殷宏，羅建勛.生防綠僵菌研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（5）：2060－2062，2077.

［8］ Milner R J，Samon P，Morton R.Persistence of conidia of Metarhizium anisopliae in sugarcane fields：effect of isolate and formulation on persistence over 3－5years［J］.Biocontrol Science and Technology，2003，13：507－516.

［9］ Booth S R，Tanigoshi L，Dewes I.Potential of a dried mycelium formulation of an indigenous stain of Metarhizium anisopliae against subterranean pests of cranberry［J］.Biocontrol Science and Technology，2000，10（5）：659－668.

［10］牛瞻光，宋國春.土壤殺蟲劑的合理使用與蠐螬天敵—土蜂的保護和利用［J］.中國生物防治，1999，15（3）：123－126.

［11］牟敦蜀，牛瞻光.毛黃鰓金龜天敵普通鉤土蜂生物學的研究［J］.昆蟲天敵，1996，18（2）：67－70.

［12］孫秀珍.一種蠐螬外寄生天敵——普通鉤土蜂［J］.植物保護，1987，13（4）：15－16.

［13］Flores A G，De La Rosa W，Rojas J C，et al.Evaluation of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae（Mitosporic）against species of the white grub complex in the south of Mexico［J］.Southwestern Entomologist，2002，47：177－192.

［14］農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物病蟲測報總站.農(nóng)作物主要病蟲測報辦法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1981.

［15］劉廣瑞，侯建恩，郭貴明.馬鈴薯地下害蟲調(diào)查及防治［J］.山西農(nóng)業(yè)大學學報，1989，12：8－11.

［16］唐啟義，馮明光.DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［M］.北京：科學出版社，2008.

［17］Bustillo A E，Bernal M G，Benavides P，et al.Dynamics of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae infecting Hypothenemus hampei（Coleoptera：Scolytidae）under field conditions［J］.Florida Entomologist，1999，82（4），491－498.

［18］Booth S R，Shanks C H.Potential of a dried rice／mycelium formulation of entomopathogenic fungi to suppress subterranean pests in small fruits［J］.Biocontrol Science and Technology，1998，8（2）：197－206.

［19］Mazodze R，Zvoutete P.Efficacy of Metarhizium anisopliae against Heteronychus licas （Scarabaedae：Dynastinae）in sugarcane in Zimbabwe［J］.Crop Protection，1999，18：571－575.

［20］U.S.Environmental Protection Agency（EPA），2009 Metarhizium anisopliae strain F52（029056）Federal Register Notices.OPPB and PPD［EB／OL］.http：∥www.epa.gov.

［21］蒲蟄龍，李增智.昆蟲真菌學［M］.合肥：安徽科學技術出版社，1996.

［22］徐秀娟.中國花生病蟲草鼠害［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009.

［23］謝寧，王中康，殷幼平，等.綠僵菌CQMa128乳粉劑對蠐螬時間－劑量－死亡率模型分析［J］.中國生物防治，2010，26（4）：436－441.

［24］江鎮(zhèn)海.毒死蜱市場及發(fā)展趨勢分析［J］.今日農(nóng)藥，2010（10）：45－46.

［25］程輝彩，劉麗云，張麗萍，等.綠僵菌防治銅綠麗金龜蠐螬藥效試驗［J］.現(xiàn)代農(nóng)藥，2007，6（5），40－41.

［26］李存煥，楊龍飛，農(nóng)向群，等.綠僵菌防治高爾夫草坪蠐螬試驗［J］.草業(yè)科學，2008，25（11）：125－128.

［27］魏海燕，農(nóng)向群，李存煥，等.綠僵菌對高爾夫球場蠐螬防治效果的比較［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2007，28（2）：125－127.

［28］ Kabaluk J T，Ericsson J D.Metarhizium anisopliae seed treatment increases yield of field corn when applied for wireworm control ［J］. Agronomy Journal，2007，99 （5）：1377－1381.

［29］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.中華人民共和國國家標準（GB／T 19378－2003）：農(nóng)藥劑型名稱及代碼［S］.北京：中國標準出版社，2003.

［30］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（NY／T 1667.1～1667.8－2008）：農(nóng)藥登記管理術語［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［31］糧農(nóng)組織和世衛(wèi)組織.農(nóng)藥標準制定和使用手冊（2005，第一版）［M／OL］.http：∥www.who.int／ctd／whopes.