紫苤藍花青素合成酶基因BocANS的克隆與分析

袁菱婧，羅 盼，蔣 明，李溫平，何建婷

(臺州學院 生命科學學院，浙江 臨海 317000)

花青素又稱花色素、花色苷，在植物中廣泛分布，是一類重要的次生代謝產物，決定葉、花和果實等的顏色，在吸引昆蟲、鳥類和獸類傳粉或傳播種子等方面起著重要作用［1］。花青素具有抗誘變、抗氧化、抗菌和抗高血壓等功效，因此，在食品加工上得到了廣泛應用，常用作天然的食品添加劑和著色劑［2－3］?；ㄇ嗨睾铣擅甘腔ㄇ嗨厣锖铣傻年P鍵酶，作用于合成途徑的倒數第二步，催化無色花色素轉變?yōu)橛猩ㄉ兀?］。近年來，科研人員對花青素合成酶的結構、作用機制、基因克隆和表達等方面開展了廣泛研究，并取得了一定進展［5－8］。

紫苤藍 (Brassica oleraceavar．caulorapa)，又名紫球莖甘藍、紫擘藍和紫芥藍頭等，為十字花科蕓薹屬蔬菜，原產地中海沿岸，作為特種蔬菜從國外引進栽培。紫苤藍具紫色膨大的球莖，形態(tài)奇特、色澤亮麗，有一定的觀賞價值，可用于庭院栽培或盆栽;球莖肉質脆嫩可口、風味獨特，可生吃、熟食或腌制，深受人們的喜愛［9］。近年來，在紫苤藍栽培技術、指紋圖譜、小孢子培養(yǎng)和組培快繁等方面有一些研究［9－13］，但有關花青素合成酶基因克隆方面未見報道。本研究以紫苤藍為材料，通過花青素合成酶基因的克隆、表達和序列分析，為該基因的功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

在花期采集紫苤藍的葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾，用75%的酒精擦拭后置于液氮，帶回實驗室備用。Taq酶購自北京鼎國生物技術有限公司，dNTP購自上海生工生物工程有限公司，TRIzol?試劑購自Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒采用SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit，購自 TaKaRa公司;PCR產物回收純化試劑盒購自碧云天生物技術研究所;pGEM T-easy載體購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA的合成

葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾RNA的分離采用TRIzol法，稱取約0.1 g樣品用于RNA的提取;cDNA第1鏈和第2鏈的合成按照試劑盒中提供的說明書進行。

1.2.2 基因的克隆

以葉片 cDNA 為模板，BocP1(5’-ATGGTGGCAGTTGAAAG-3’) 和 BocP2(5’-TCAGACTTCATCCTTT-3’)為引物，進行 PCR擴增。在20 μL體系中，分別加入 cDNA模板40 ng，Taq酶 1 U，Taq酶緩沖液 2 μL，10 mmol·L－1的dNTP 0.5 μL，20 μmol·L－1的引物各 0.5 μL，并用無菌dd H2O補足20 μL。PCR程序為:94℃預變性 5 min，每個循環(huán)包括 94℃變性 30 s，55.6℃退火60 s，72℃延伸90 s，共32次，最后72℃繼續(xù)延伸 10 min。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經割膠、回收和純化后，克隆到pGEM T-easy載體，經藍白斑篩選、菌液PCR驗證后挑取陽性克隆測序。

1.2.3 基因的表達分析

根據測序結果，設計RT-PCR引物用于表達分析，上、下游引物序列分別為 BocRT1(5’-GCTCAAGAAGGCGGCTAT-3’) 和 BocRT2(5’-CCAATCCACGGTGAAGTA-3’)。分別以 40 ng葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾cDNA為模板進行PCR擴增，PCR體系同1.2.2。PCR程序為:94℃預變性5 min，每個循環(huán)包括94℃變性30 s，53.8℃退火40 s，72℃延伸45 s，共33次。

2 結果與分析

2.1 BocANS基因的克隆

以BocP1和BocP2為PCR引物，從葉片cDNA中擴增到與預期大小一致的條帶，經回收、連接、轉化和測序，獲得BocANS基因的序列。BocANS的編碼區(qū)全長為1 077 bp，編碼358個氨基酸，A，C，G，T 4種堿基分別為 326，206，287和 258個，GC值45.78% (圖1)。在 NCBI數據庫比對的結果表明，BocANS與甘藍花青素合成酶基因的序列最為相似，一致性達99%，僅存在3個堿基的差異，與白菜有96%的相似性，存在4個堿基的差異;通過比對發(fā)現，BocANS的編碼蛋白含兩個保守的結構域，分別為 2OG-FeII_ Oxy和DIOX_N。

圖1 紫苤藍BocANS基因的編碼區(qū)全長序列及其推導的氨基酸序列

2.2 BocANS基因的表達分析

根據測序結果，設計RT-PCR引物BocRT1和BocRT2以等量的葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾為模板，進行 PCR擴增。RT-PCR結果 (圖2)表明，BocANS在葉片、葉柄、莖、花柄和花蕾中均有表達，在葉柄和莖中的表達量較高，而其他部位相對較低。

2.3 BocANS的序列分析

圖2 BocANS基因的表達模式

從NCBI數據庫下載甘藍 (登錄號AAO73440，后略)、芥菜 (B．juncea，ACH58397)、桃形李(Prunus salicinavar．cordata，AEN19292)、蘋 果(Malusxdomestica，BAB92998)、甘薯 (Ipomoeabatatas，ADE08370)、 圓 葉 牽 牛 (I．purpurea，ABW69684)、王妃藤 (I．horsfalliae，ACS71531)、牽牛 (I．nil，BAB71810)、水稻 (Oryza sativa，CAA69252)和 小 麥 (Triticumaestivum，BAE98277)的氨基酸序列，用Clustalx 1.81進行序列比對，再用 Mega 3.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3)，構建方法為鄰接法 (Neighbor-joining)，經1 000次自舉檢驗。

結果表明，11條氨基酸序列的長度范圍為357～438，殘基之間存在一定的差異。紫苤藍與甘藍ANS之間的差異最小，僅存在個別殘基的差異，兩者的遺傳距離0.008 7;紫苤藍、甘藍與小麥ANS之間的差異最大，兩者的遺傳距離均為0.783 8。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，3種蕓薹屬蔬菜即紫苤藍、甘藍與芥菜聚為一組，薔薇科的桃形李與蘋果聚為一組，旋花科的王妃藤、甘薯、圓葉牽牛和牽牛處于同一分支，而單子葉植物小麥和水稻單獨聚為一組 (圖3)。

圖3 用NJ法構建的花青素合成酶基因編碼蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結和討論

在自然界中，存在多種類型的植物色素，如類黃酮、類胡蘿卜素、多酚化合物和生物堿類等。花青素屬于類黃酮物質，基本結構為2-苯基苯并吡喃，環(huán)上的氫被羥基或甲氧基取代后生成不同類型的花色素。由于花青素具有較好的保健和藥用功效，富含花青素的作物如紫甘薯、紫苤藍、紫菜薹、紫玉米、紫花生和黑豆等深受消費者的歡迎。通過基因工程，在植物或微生物中導入花青素合成酶基因獲得高含量花青素已成為可能。近年來在蔬菜、食品、飼料和制藥行業(yè)中已得到了應用［14－15］。目前，科研人員已從紫甘薯、紫菜薹等紫色作物中克隆得到花青素合成酶基因［1，16］。

本研究從紫苤藍中克隆到一個花青素合成酶基因，該基因的開放閱讀框大小與實驗室先前在紫菜薹中克隆到的BcANS一樣，均為1 077 bp，編碼358個氨基酸［16］;RT-PCR 結果表明，BocANS在葉片、葉柄、莖、花柄和花蕾中表達，表達模式與BcANS類似，推測它們?yōu)橥椿?。BocANS的堿基組成、序列長度與同屬植物十分接近，但與不同科植物相比，堿基組成和長度差異較大，說明ANS在進化上比較保守，這一規(guī)律與傳統(tǒng)的植物分類相吻合。紫苤藍花青素合成酶基因的克隆，為研究該基因的功能奠定了基礎，下一步將構建植物表達載體和開展轉基因研究。

［1］Liu XQ，Chen M，Li MY，et al．The anthocyanidin synthase gene from sweetpotato［Ipomoea batatas(L．)Lam］:Cloning，characterization and tissue expression analysis［J］．African Journal of Biotechnology，2010，9(25):3748－3752．

［2］Parejo I，Viladomat F，Bastida J，et al．Bioguided isolation and identification of the nonvolatile antioxidant compounds from fennel(Foeniculum vulgareMill．)waste ［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52:1890－1897．

［3］陳健，孫愛東，高雪娟．藍莓花青素的提取及抗氧化性的研究 ［J］．北京林業(yè)大學學報，2011，33(2):126－129．

［4］Winkel-Shirley B．Biosynthesis of flavonoids and effects of stress［J］．Current Opinion in Plant Biology，2002，5(3):218－223．

［5］Cheng L Q，Xu Y J，Grotewold E，et al．Characterization of anthocyanidin synthase(ANS)gene and anthocyanidin in rare medicinal plant-Saussurea medusa［J］．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2007(89):63－73．

［6］Wilmouth R C，Turnbull J J，Welford R W，et al．Structure and mechanism ofanthocyanidin synthasefromArabidopsis thaliana［J］．Structure，2002，10(1):93 －103．

［7］Xu F，Cheng H，Cai R，et al．Molecular cloning and function analysis of an anthocyanidin synthase gene fromGinkgo biloba，and its expression in abiotic stress responses［J］．Molecular Cells，2008，26(6):536－547．

［8］Nakajima J，Sato Y，Hoshino T，et al．Mechanistic study on the oxidation of anthocyanidin synthase by quantum mechanical calculation ［J］．The Journal of Biological Chemistry，2006，281(30):21387－21398．

［9］隋好林，于堯，張志芬．紫莖藍引種栽培試驗 ［J］．山東農業(yè)科學，1996(4):24－25．

［10］林驍．特菜新品種:紫苤藍栽培技術 ［J］．農村實用技術，2005(1):12－12．

［11］周榮，任吉君，王艷．POD、PPO指紋圖譜在蕓薹屬蔬菜分類上的研究 ［J］．中山大學學報:自然科學版，2010，49(4):106－110．

［12］王超楠，聞鳳英，劉曉暉，等．球莖甘藍小孢子培養(yǎng)中影響胚誘導的幾個因素 ［J］．中國蔬菜，2010(10):35－39．

［13］倪春鋒，蔣明，胡齊贊，等．紫苤藍組織培養(yǎng)快繁技術［J］．浙江農業(yè)科學，2010(3):503－506．

［14］Yan Y，Chemler J，Huang L，et al．Metabolic engineering of anthocyanin biosynthesis inEscherichia coli［J］．Applied and Environmental Microbiology，2005，7:3617－3623．

［15］Reddy AM，Reddy VS，Scheffler BE，et al．Novel transgenic rice overexpressing anthocyanidin synthase accumulates a mixture of flavonoids leading to an increased antioxidant potential［J］．Metabolic engineering，2007，9(1):95 －111．

［16］蔣明，陳孝賞，李金枝．紫菜薹花青素合成酶基因BcANS的克隆、表達與序列分析 ［J］．浙江大學學報:農業(yè)與生命科學版，2011，37(4):393－398．