薏仁多糖誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡

盧相義 劉薇 羅成

薏米（Coix）別名薏苡仁、米仁、薏珠子、菩提子、芑實(shí)、解蠡等，廣泛地種植于亞洲、非洲和地中海周邊的溫暖地區(qū)。薏米的干燥成熟種仁叫做薏仁，薏仁質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面白色，粉性，氣微，味微甜，薏仁通過(guò)烘烤或加工成薏米粉食用[1]。它含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽，其中主要的功能性成分是脂肪和糖類(lèi)。在傳統(tǒng)的中藥中作為一種利尿劑、抗炎藥物、抗癌藥物、鎮(zhèn)痛劑和一種營(yíng)養(yǎng)物[2]。研究表明薏仁中含有大量脂肪酸包括棕櫚酸、硬脂酸、十八碳二烯酸、硬脂酸、油酸、亞油酸等[3]，其中含有的寡聚糖具有DPPH自由基清除能力和脂質(zhì)抗氧化能力[4]。薏仁組份已被證實(shí)具有降血糖[5]，提高免疫力[6]等作用。本研究提取純化得到薏仁多糖（CP-1）并作用于肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，觀(guān)察其對(duì)肺癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡作用的影響，為以后進(jìn)一步研究CP-1的抗腫瘤作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室自有；薏仁購(gòu)于天津?yàn)I海新區(qū)TESCO超市；DEAE-52柱材料購(gòu)于北京索萊寶公司；淀粉酶購(gòu)于北京索萊寶公司；糖化酶購(gòu)于北京索萊寶公司；透析袋購(gòu)于上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于GIBCO公司；改良型PRMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；1%青鏈霉素混合液購(gòu)于北京索萊寶公司；胰酶購(gòu)于北京索萊寶公司；二甲基亞砜分析純購(gòu)于北京索萊寶公司；噻唑藍(lán)購(gòu)于北京索萊寶公司；多聚甲醛購(gòu)于北京索萊寶公司；碘化丙啶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；RNase Inhibitor購(gòu)于美國(guó)MBI公司；總RNA提取試劑盒Qiagen購(gòu)于德國(guó)Hilden公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas購(gòu)于美國(guó)Hanover公司；其它試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 KW-1000DC恒溫水浴鍋購(gòu)自金壇市瑞華儀器有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；SU-1510電子掃描顯微鏡購(gòu)自日本日立公司；真空冷凍干燥機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；BT-200B數(shù)顯恒流泵購(gòu)自上海滬西分析儀器有限公司；紫外全波長(zhǎng)掃描儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；EOVS-FL倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)AMG公司；Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；PCR儀購(gòu)自德國(guó)biometra公司；DYY-8C電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠(chǎng)；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-RAD公司。

1.3 薏仁多糖的提取

1.3.1 薏仁多糖提取工藝流程 薏仁→篩選→粉碎→脫脂→提取→去淀粉→濃縮→醇沉→干燥→薏仁粗多糖。

1.3.2 薏仁多糖提取 挑選籽粒飽滿(mǎn)、色澤潔白、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉斑的薏仁置于超微粉碎機(jī)中，粉碎過(guò)篩。使用索式提取器分別用乙酸乙酯和石油醚脫脂，置于三角瓶中，加pH 5.2的蒸餾水于水浴鍋中90oC提取。提取后趁熱離心，取上清液冷卻，按20 IU/g加淀粉酶到提取液中水浴溫度60oC、pH7.0去淀粉直到碘檢不變色；接著按18 IU/g加糖化酶，在水浴溫度 50oC-60oC，pH6.5條件下處理1 h。100oC水浴條件下滅活酶10 min，然后在3,000 r/min下離心10 min，上清液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加入3倍濃縮液體積的95%冰乙醇沉淀過(guò)夜離心，真空冷凍干燥沉淀得薏仁粗多糖。

1.4 薏仁多糖的純化

1.4.1 純化工藝流程 薏仁粗多糖→脫蛋白→脫色→透析→DEAE-52柱層析→真空冷凍干燥→CP-1。

1.4.2 脫蛋白 將CP-1粉末溶解在蒸餾水中，加入1/3體積的Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1），劇烈震蕩30 min，3,000 r/min離心15 min，用分液漏斗除去有機(jī)相與水相之間的變形蛋白沉淀，水相重復(fù)上述操作，至沒(méi)有變性蛋白沉淀產(chǎn)生。用3倍體積95%冰乙醇沉淀，離心，蒸餾水溶解。

1.4.3 脫色 CP-1水溶液以濃氨水調(diào)至pH8.0滴加30%H2O2至淺黃色，于50oC水浴保溫2 h。

1.4.4 透析 用截留相對(duì)分子質(zhì)量為8,000-14,000的透析袋流水透析2 d。透析后將CP-1濃縮，真空冷凍干燥。

1.4.5 DEAE-52離子交換柱層析 在DEAE-52纖維素層析柱中，加樣 5 mL以0.1 mol/L NaCl溶液洗脫（恒流泵流速：1.8 r/min-2.1 r/min，5 mL/管）用苯酚硫酸法監(jiān)測(cè)換位檢測(cè)。將含有CP-1的部分合并，濃縮，真空冷凍干燥得CP-1純品。苯酚硫酸法測(cè)得CP-1的糖含量為85%。

1.5 紫外全波長(zhǎng)掃描 將CP-1溶解于甲醇中，于200 nm-800 nm區(qū)間進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，觀(guān)察在260 nm、280 nm處是否有吸收峰。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液（100×）的改良型PRMI-1640培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱（37oC、5%CO2）中恒溫培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 MTT檢測(cè)對(duì)A549細(xì)胞存活率影響 對(duì)數(shù)期成長(zhǎng)的細(xì)胞，胰酶消化，培養(yǎng)于96孔板中，加入不同濃度的CP-1（0、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和300 μg/mL）處理24 h、48 h、72 h之后避光加入5 mg/mL的MTT（噻唑藍(lán)）20 μL 37oC培養(yǎng)4 h，3,000 r/min離心5 min，吸去上清，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）。用微型振蕩器振蕩混勻，酶標(biāo)儀在570 nm下測(cè)定吸光度值，以DMSO處理的A549細(xì)胞作為陰性對(duì)照組細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 A549細(xì)胞凋亡形態(tài)的電子掃描顯微鏡觀(guān)察 對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，不同濃度CP-1（200 μg/mL和300 μg/mL）處理24 h，用PBS緩沖液洗滌。按一定方向輕輕搖動(dòng)。洗滌2次，每次5 min。用2.5%的戊二醛（pH為7.2-7.4）固定液，于4oC冰箱內(nèi)固定1 h。PBS再次清洗樣品，濃度依次為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇梯度脫水去除樣品中水分，每次脫水時(shí)間5 min。將樣品進(jìn)行自然干燥，PBS洗3次，電子掃描顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

1.9 單細(xì)胞凝膠電泳測(cè)定A549細(xì)胞DNA損傷 A549細(xì)胞用冰冷的PBS洗1次，離心收集，用PBS重懸密度為1×106個(gè)/mL；將載玻片的磨砂面向上，40oC預(yù)熱，將預(yù)熱45oC的100 μL的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA）鋪于載玻片上，蓋上干凈的蓋玻片，再置于4oC環(huán)境中10 min使NMA凝固。將10 μL細(xì)胞（約1×104個(gè)）和75 μL的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA（在37oC下水浴加熱至少20 min使之完全溶化）混合均勻。輕輕揭去蓋玻片，迅速將含細(xì)胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片，置4oC、10 min使第2層LMA凝固。第2層LMA凝固后，室溫下移去蓋玻片，滴加預(yù)熱37oC的75 μL的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA，蓋上蓋玻片4oC下凝固。移去蓋玻片，將玻片置于平皿中，倒入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，4oC裂解1 h-2 h，取出載玻片用PBS漂洗。將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液（1 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaOH），約覆過(guò)載玻片膠面0.25 cm左右，室溫放置20 min-60 min。在電壓25 V條件下，電泳20 min-30 min。電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入0.4 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液，將載玻片沒(méi)入，4oC中和3次，每次10 min，棄去Tris-HCl緩沖液，每個(gè)載玻片加20 μL的PI染液，蓋上蓋玻片，避光染色10 min。激光共聚焦顯微鏡543 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光觀(guān)察。

1.10 細(xì)胞周期分析 A549細(xì)胞接種在六孔板中，不同濃度CP-1（0、100 μg/mL、200 μg/mL和300 μg/mL）處理，培養(yǎng)72 h后，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，PBS洗兩次，4%多聚甲醛固定4oC過(guò)夜。固定的細(xì)胞800 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗2遍，加入終濃度為50 U/mL的RNase Inhibitor，37oC水浴30 min。加入終濃度為50 μg/mL的碘化丙啶（PI），室溫避光40 min，過(guò)400目篩，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.11 總RNA提取及半定量PCR（RT-PCR） A549細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，分為空白組、CP-1組（200 μg/mL和300 μg/mL）。加CP-1后培養(yǎng)24 h。按總RNA提取試劑盒（Qiagen）說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，提取的總RNA結(jié)果通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在50 μl的PCR反應(yīng)體系中，加入2 μL的cDNA、5 μL的反應(yīng)緩沖液（10×）、2 μL的dNTP及正、反向引物各1.5 μL、5 U的耐熱多聚核酸聚合酶（Taq酶）、38 μL的去核酸雙蒸水，置于PCR儀中，93oC預(yù)變性3 min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94oC變性30 s，58oC退火30 s，72oC延伸45 s），72oC延伸10 min。半胱天冬酶（caspase）-3、caspase-9和β-actin引物序列見(jiàn)表1。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行 t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示。采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外全波長(zhǎng)掃描檢測(cè) 紫外全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)顯示，在260 nm、280 nm處沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明純化后的CP-1中不含核酸和蛋白質(zhì)。

2.2 薏仁多糖對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響 使用MTT檢測(cè)CP-1對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞存活率結(jié)果如圖1，CP-1對(duì)細(xì)胞的抑制作用具有明顯的作用時(shí)間和作用濃度依賴(lài)性。CP-1對(duì)A549細(xì)胞的存活率影響明顯（P＜0.05），當(dāng)CP-1的濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，作用72 h，細(xì)胞存活率為62.77%。

2.3 A549細(xì)胞掃描電子顯微鏡觀(guān)察結(jié)果 掃描電子顯微鏡下觀(guān)察經(jīng)CP-1處理的A549細(xì)胞和空白組細(xì)胞。觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)圖2?？瞻捉M細(xì)胞，細(xì)胞表面有小的絨毛，并有小的凸起；200 μg/mL CP-1組細(xì)胞核細(xì)胞凸起開(kāi)始增加、變大，細(xì)胞表面形成褶皺；300 μg/mL CP-1組細(xì)胞表面形成大量凸起，并產(chǎn)生凋亡小體。

2.4 單細(xì)胞凝膠電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）測(cè)定A549細(xì)胞DNA損傷 A549細(xì)胞的單細(xì)胞凝膠電泳在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果如圖3（x,y: 50 μm），空白組無(wú)DNA損傷的細(xì)胞表現(xiàn)為一圓形熒光細(xì)胞核，200 μg/mL、300 μg/mL組的DNA彗星頭很小，頭長(zhǎng)不超過(guò)5 μm，亮度高，慧尾近似橢圓形，在細(xì)胞后面形成長(zhǎng)的拖尾，呈典型的凋亡彗星尾形狀。結(jié)果顯示CP-1作用后彗星尾距較空白組均增加，差異明顯（P＜0.05），且二者的改變與作用時(shí)間相關(guān)。

2.5 薏仁多糖誘引起S期阻滯 CP-1對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4。在濃度為300 μg/mL時(shí)CP-1造成A549細(xì)胞凋亡率較為明顯（22.06%）。和空白組相比CP-1形成明顯的S期阻滯。

2.6 RT-PCR測(cè)定caspase-3、caspase-9基因表達(dá) 不同濃度CP-1作用于A549細(xì)胞前后，A549細(xì)胞中的caspase-3、caspase-9基因表達(dá)的相對(duì)表達(dá)量（caspase-3/β-actin和caspase-9/β-actin）見(jiàn)圖5A。不同濃度CP-1作用于A549細(xì)胞后caspase-3、caspase-9兩種基因的相對(duì)表達(dá)量明顯增加，兩種基因表達(dá)的差異明顯（P＜0.05）（圖 5B）。

表1 引物列表Tab 1 List of primers used in polymerase chain reactions

圖1 CP-1對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（n=3）（*P＜0.05）Fig 1 Effect of CP-1 on the cell viability of A549 cells (n=3) (*P＜0.05)

圖2 A549細(xì)胞SEM觀(guān)察結(jié)果Fig 2 The morphology of A549 cells observed by SEM

圖3 A：A549細(xì)胞單細(xì)胞凝膠電泳圖（比例棒：50 μM）；B：CP-1對(duì)慧星尾距計(jì)算值的影響（*P＜0.05）。Fig 3 A: Single cell gel electrophoresis of A549 (scale bar:50 μm) ； B: The effect of CP-1 in the calculation of comet tail (*P＜0.05).

圖4 ACP-1對(duì)A549細(xì)胞周期（DNA含量）的影響（*P＜0.05）。Fig 4 Effect of CP-1 on the cell cycle of A549 cells (*P＜0.05).

圖5 CP-1作用后A549細(xì)胞caspase-3和caspase-9的相對(duì)表達(dá)量。A: RT-PCR的1.2%瓊脂糖凝膠電泳；M：Marker； 2：Control； 3：200 μg/mL； 4：300 μg/mL。B：基因相對(duì)表達(dá)量（*P＜0.05）。Fig 5 The relative quantity of caspase-3 and caspase-9 in A549 cells after CP-1 treatment. A: Electrophoresis of RT-PCR of caspase-3 and caspase-9；M: Marker； 2: Control； 3: 200 μg/mL； 4: 300 μg/mL. B: Relative optical density (ROD) of the gene expression (*P＜0.05).

3 討論

肺癌仍然是癌癥死亡的主要原因，是當(dāng)今社會(huì)主要的醫(yī)療、科學(xué)、社會(huì)問(wèn)題[7]，目前對(duì)于惡性腫瘤的臨床治療手段主要包括放療、化療或者手術(shù)切除等[8]。近年來(lái)傳統(tǒng)中藥的抗癌成分備受人們關(guān)注。多糖是植物、真菌、酵母等的主要組成部分，由于多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制和抗癌作用，現(xiàn)在多糖的研究引起了越來(lái)越多的關(guān)注[9]。一些多糖具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，其中一些多糖表現(xiàn)出很明顯的凋亡作用，但沒(méi)副作用[10,11]。癌癥的產(chǎn)生與發(fā)展是由于癌細(xì)胞的凋亡功能喪失，使之高增殖與擴(kuò)散，研究細(xì)胞凋亡對(duì)于癌癥的研究具有很大的意義[12]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)CP-1組分誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的能力進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)（MTT檢測(cè)）表明CP-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)凋亡峰，并且造成細(xì)胞周期S期阻滯，該作用與一些其它多糖的作用類(lèi)似，比如枸杞多糖[13]。通過(guò)掃描電鏡我們觀(guān)察到細(xì)胞凋亡前的特征圖像，單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明CP-1處理后的彗星尾距拉長(zhǎng)也清晰地表明CP-1組分可誘導(dǎo)凋亡。從分子機(jī)理研究，caspase家族在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起核心作用[14,15]。caspase-3是凋亡過(guò)程中細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，是多種死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，能夠降解細(xì)胞骨架蛋白和核蛋白[16,17]。caspase-3活化后，可酶解、切割特異性底物如DNA依賴(lài)性蛋白激酶、固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白等，通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)或影響特定信號(hào)分子而引起細(xì)胞凋亡[18]。caspase-9屬于上游蛋白酶，起到活化caspase-3的作用。RT-PCR顯示CP-1使caspase-3和caspase-9表達(dá)量提高，表明CP-1通過(guò)影響caspase-3和caspase-9表達(dá)導(dǎo)致A549的細(xì)胞凋亡。

從以上結(jié)果分析，CP-1能夠降低A549細(xì)胞存活率，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的caspase-3、caspase-9基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體，S期阻滯，表明薏仁多糖可以誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡。該研究為以后進(jìn)一步研究CP-1的抗腫瘤作用提供了有價(jià)值的參考。