人肺腺癌細胞系Ch-Huang-1的建立和生物學特性研究

李白翎 鐘鏗 金磊 袁揚 龔德軍 劉曉紅 黃盛東

肺癌已成為當今世界發(fā)病率和死亡率增長最快且嚴重危害人類健康和生命的惡性腫瘤；而肺腺癌是肺癌中最常見的組織類型之一，且發(fā)病率逐年上升[1]。因此，對肺腺癌的研究顯得尤為重要。建立肺腺癌細胞系對于研究肺癌癌變、侵襲轉移、多藥耐藥的分子機制、生物學特征以及開發(fā)抗肺癌新藥等均有十分重要的理論和臨床意義。由于肺是一個開放性器官，其腫瘤組織易受細菌、霉菌的污染，較難培養(yǎng)[2]。我們利用1例原發(fā)性肺腺癌的腫瘤手術標本，采用原代培養(yǎng)方法建立了一個新的細胞系Ch-Huang-1，為肺腺癌研究工作提供新的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本取自長海醫(yī)院胸心外科46歲女性原發(fā)性肺腺癌IIIb期患者。病理診斷：右肺下葉低分化腺癌。支氣管斷端“-”，肺門淋巴結、第8組淋巴結癌轉移“+”。

1.2 培養(yǎng)方法 將腫瘤標本浸入含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，送胸心外科實驗室。在無菌條件下，用含有10%胎牛血清和青霉素及鏈霉素（各100 mg/mL）的PBS沖洗，剔除血管、包膜和壞死組織后剪成約1 mm3的組織塊，充分洗滌。在無菌條件下，將剪好的組織塊貼于含少量培養(yǎng)液的25 mL培養(yǎng)瓶壁上，每瓶10塊，置于37oC、CO2孵箱。4 h后接觸培養(yǎng)液，使組織塊浸于培養(yǎng)液中[3]。4 d后半量換液。20 d后出現細胞克隆，將克隆挑出，胰酶消化傳代1次。細胞長至80%左右傳代。早期細胞形態(tài)以貼壁細胞為主，多為大小不等的多邊形，核大，可見分裂相。分裂后細胞仍呈貼壁狀，細胞異質性明顯。

1.3 生長曲線 取對數生長期的第5代細胞經胰酶消化后，稀釋成細胞懸液進行計數，并調整濃度為每毫升細胞懸液含100,000個細胞，然后0.1 mL/孔（100個細胞）分別加入到24孔板的相應孔中，并用完全培養(yǎng)基補足體積至0.5 mL。每天取出3個孔的細胞進行計數，連續(xù)9 d進行細胞計數。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數為縱軸，繪制生長曲線。

1.4 分裂指數 取第5代細胞懸液接種于事先放置有小蓋玻片的6孔板內，接種要求同生長曲線。每24 h取出一個玻片，按常規(guī)方法95%酒精固定，Giemsa染色。選擇細胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細胞，進行細胞計數。每個時間組的玻片各取細胞數多、中、少各一區(qū)，共1,000個細胞。

1.5 克隆形成率 接種分散均勻的第5代細胞于6孔板中，每孔1,000個細胞，靜止培養(yǎng)2周-3周。當培養(yǎng)板中出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。甲醇固定加適量Giemsa染色，計數克隆數。

1.6 組織起源鑒定 細胞懸液種到無菌載玻片，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)至細胞完全伸展、貼壁，PBS洗，滴加SPC抗體，37oC、1 h，PBS洗，滴加FITC標記的二抗，37oC避光30 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 染色體分析 在第5代細胞的對數生長期加秋水仙素作用2 h，經0.075 mol/L KCl低滲、甲醇-冰醋酸（3:1）固定處理，冰濕片滴片，室溫老化后用胰酶處理，Giemsa染色顯帶分析。

1.8 免疫缺陷小鼠成瘤實驗 在4周-6周齡小鼠背部皮下注射2×106個/0.2 mL收獲呈指數生長的培養(yǎng)細胞，1代-4代細胞60 d后仍不致瘤，傳至第5代才致瘤。1周時可觸摸到腫塊生長，觀察瘤結節(jié)形成情況。

2 結果

2.1 形態(tài)現察 活細胞形態(tài)采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)細胞（圖1A），聯合采用機械刮除、反復貼壁等方法去除成纖維細胞，建立可傳代細胞系；倒置顯微鏡下細胞大小不等，癌細胞呈團塊狀分布，細胞體積小，呈圓形，細胞鋪滿瓶底后有重疊現象。目前，所建立的肺腺癌可傳代細胞系已傳至第70代，細胞形態(tài)和生長速度不變。凍存后復蘇良好，可以認為基本建系。從第2代傳代后細胞多呈多角形。少數為梭形或圓形（圖1B）。

2.2 生長曲線 生長曲線呈S型；在生長曲線的對數生長期取細胞數成倍生長的兩個點作垂直線測定時間，細胞群體倍增時間為36 h（圖2）。

2.3 分裂指數 分裂指數=分裂相細胞數平均值/總細胞數平均值（圖3），分裂指數曲線為倒V字型，培養(yǎng)第30小時處于分裂期的細胞最多。

2.4 克隆形成率 計算出克隆形成率：克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%，本研究克隆形成率為0.803%±0.078%。

2.5 組織起源鑒定 熒光顯微鏡下可以觀察到90%的培養(yǎng)細胞表達II型肺泡（alveolar type II, ATII）上皮細胞標志蛋白：疏水性表面活性蛋白C（surfactant protein C, SPC）（圖4），提示其起源于ATII細胞。

2.6 染色體分析 在顯微鏡下選擇分散良好且比較完整的第12代中期分裂象進行觀察，計數100個分裂象的染色體數目。觀察到各細胞內染色體數目分布在35-44之間。染色體數目為亞三倍體，有明顯的染色體異常（圖5）。

2.7 免疫缺陷小鼠成瘤實驗 裸鼠皮下種植1代-4代細胞均不致瘤，傳至第5代后100%致瘤。4周瘤塊長至直徑約0.8 cm-1.0 cm左右時，用斷頸法將鼠處死（圖6）。常規(guī)HE染色觀察細胞生長旺盛，細胞核不均勻增大，異型性明顯，其組織學形態(tài)與原發(fā)瘤相似。目前傳代至第70代，致瘤效果未有衰退。

3 討論

圖1 倒置顯微鏡光鏡觀察：細胞多呈多角形，少數為梭形或圓形（×200）。A：原代培養(yǎng)細胞；B：傳代細胞。Fig 1 Most cells were polygonal and a few were spindle or round (×200). A: primary cultured cells; B: passage cells.

圖2 細胞生長曲線圖Fig 2 Growth curve of cells line Ch-Huang-1

圖3 細胞分裂指數分析Fig 3 Analysis of cells division index

圖4 細胞組織起源鑒定（DAB，×200）Fig 4 Identification of the cellular tissue origin (DAB, ×200)

圖5 染色體核型分析Fig 5 Chromosomal instability in Ch-Huang-1

圖6 移植瘤癌細胞生長旺盛（HE，×40）。A：原代培養(yǎng)用組織塊；B：移植瘤細胞。Fig 6 Vigorous growth of transplanted tumor cells (HE, ×40). A: primary tissue culture cells; B:transplantation tumor cells.

應用體外建立的腫瘤細胞系進行研究，對揭示腫瘤的發(fā)病機制、尋找診斷腫瘤的有用指標和探索實驗性的治療方案都能提供十分有價值的參考資料。然而，成功建立一個原發(fā)腫瘤的永生化細胞系是很困難的。而作為一株合格的細胞系，應當符合以下標準[4-6]：在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，能連續(xù)傳代；細胞生長特性明確；有遺傳學分析；腫瘤標記物測定；異種成瘤性測定；無污染。我們利用術中取得的肺腺癌標本，通過完整組織塊原代培養(yǎng)、皮下移植瘤模型構建、皮下移植瘤原代培養(yǎng)等一系列方法建立腫瘤細胞系。本實驗應用組織塊法獲得肺腺癌原代細胞，為建立細胞系奠定了基礎。Ch-Huang-1細胞系至今在體外培養(yǎng)已經超過1年，且生長穩(wěn)定，能夠連續(xù)傳代。Ch-Huang-1細胞系在體外培養(yǎng)過程中，接觸性抑制消失，重疊性生長，反映了腫瘤細胞惡性增殖的特點[7]。

本細胞系所描繪的生長曲線細胞呈"S”型，符合無限細胞系的特點。軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示，Ch-Huang-1細胞具有非貼壁依賴性生長特性，能夠進行自主性增殖，表現出惡性腫瘤細胞的重要特征[8]。通過細胞核型分析顯示：來源于人類的非整倍體細胞、多倍體細胞的出現代表著基因拷貝量的大量增加、核分裂加速、細胞增殖失控、核漿分裂失衡等細胞惡性增殖特性，異常染色體及端著絲粒等染色體結構異?？赡芘c細胞錨著獨立性生長能力、生長增殖優(yōu)勢及成瘤性等惡性細胞特性有明顯關聯[9-11]。本研究對細胞核型進行分析后顯示該細胞系存在染色體數量和結構的異常。我們觀察到各細胞內染色體數目分布在35-44之間。染色體數目為亞三倍體，有明顯的染色體異常。這為以后從遺傳學角度尋找肺腺癌形成機制提供了實驗資料。

本研究顯示我們所建Ch-Huang-1細胞系具有典型的惡性細胞形態(tài)特點；免疫缺陷小鼠經接種細胞后產生移植瘤，其組織病理學特征與原發(fā)腫瘤特征一致。經長期傳代培養(yǎng)其形態(tài)學、細胞動力學及染色體眾數等指標無明顯改變，表明該細胞系生長穩(wěn)定，符合一般體外培養(yǎng)細胞系標準。

綜上所述，人肺腺癌細胞系Ch-Huang-1的建立可為深入研究肺腺癌的發(fā)病機制、生物學行為提供細胞學實驗模型，并為進一步開展分子生物學、免疫學及臨床診斷、治療等研究提供有利條件。