家蠶品種間及雜交后代超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力的探索研究

阮氏茉莉 林健榮

(1華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院蠶絲科學系，廣東廣州 510642; 2越南蠶桑絲研究中心，越南河內(nèi) 10000)

生物體在代謝過程中會產(chǎn)生各種自由基，主要是超氧陰離子自由基(·O－2)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)等。這些自由基有很強的氧化能力，對許多生物功能分子有破壞作用。同時，生物體內(nèi)存在超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)等清除自由基的酶類。在正常生理條件下，自由基不斷產(chǎn)生，同時被不斷清除，維持濃度極低的平衡狀態(tài)。H2O2能使SOD失活，CAT和POD可清除H2O2，保護SOD;超氧陰離子自由基可使CAT和POD失活，SOD可清除超氧陰離子自由基，保護CAT和POD。這3種酶組成了相互保護清除自由基的系統(tǒng)，稱為保護酶系統(tǒng)［1］。

SOD具有清除自由基，保護機體免遭傷害的功能。從生化角度探討家蠶SOD的遺傳性及其與經(jīng)濟性狀的相關(guān)性，對育種工作具有重要的指導意義。陳田飛等［2］通過研究表明，SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御體系的重要酶類，精液用不同冷凍方式及不同冷凍時間冷藏SOD活性不同。魏國清等［3］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種之間蠶卵SOD酶的活力相近。劉春等［4］研究表明，一代雜交種的活性值居雙親活性值中間。姜峰等［5］研究表明，家蠶5齡第4天血液中的CAT、CarE的活性均表現(xiàn)為雄蠶大于雌蠶，而SOD的活性則雌蠶大于雄蠶。

科研人員對CAT活性與家蠶經(jīng)濟性狀相關(guān)性也進行了一些探索研究。陳萍等［6－7］研究了家蠶血液CAT的活性與育種中經(jīng)濟性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明:CAT活性與5齡歷期、同宮繭率無關(guān)，與全齡期、死籠繭率、普通繭率呈一定的負相關(guān)，與全繭量、繭層量、繭層率呈不顯著的正相關(guān)，與萬頭產(chǎn)繭量、萬頭繭層量呈正相關(guān)，而與蟲蛹率、幼蟲生命率呈顯著正相關(guān)。吳小鋒等［8］認為家蠶血液CAT活力與其發(fā)育變態(tài)、體內(nèi)代謝均有密切的關(guān)系，逆境條件下CAT活力變化幅度的大小可以作為家蠶抗逆性強弱的一個重要生理指標。李群等［9］認為柞蠶絲腺CAT活性與生命力性狀(包括收蟻結(jié)繭率)和產(chǎn)量性狀(包括結(jié)繭數(shù)和繭層量)均呈顯著正相關(guān)，而且與其雜種優(yōu)勢也呈顯著的正相關(guān)關(guān)系;因此，絲腺CAT活性可作為一種生化指標用于預測柞蠶的雜種優(yōu)勢。本研究檢測了親本和F1代蠶卵的SOD、CAT活力，不同繭色蠶品種、不同性別的幼蟲血、蛹血的CAT、SOD的活力變化，試驗結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試蠶品種:原種是新九、黃白限(營白色繭的是雄、營黃色繭是雌)、大造(綠色繭)、沔赤(紅色繭)，一代雜交種是新九×黃白限、黃白限×新九;所有品種均由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院蠶絲科學系蠶種室保存提供。

主要試劑:K2HPO4、KH2PO4、NaCl、乙醇、磷酸、牛血清白蛋白為北京鼎國公司產(chǎn)品;SOD試劑盒、CAT試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 親本和F1代蠶卵的SOD、CAT活力的測定

蠶卵蛋白的提取:分別取新九、黃白限、新九×黃白限、黃白限×新九的蠶卵0.15 g，置于研缽中，加入1.5 mL磷酸抽提緩沖液，冰浴研磨15 min，超聲波處理3 min，4 ℃、10 000 r/min，離心 20 min，沉淀保存。上清液再經(jīng)4℃、10 000 r/min離心15 min，收集上清液作為蠶卵可溶性總蛋白質(zhì)的樣品，分裝，于－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笥肂radford法［10］測定各樣品的蛋白含量，再分別按照CAT、SOD試劑盒說明書測定蠶卵SOD、CAT的活力。

1.2.2 不同繭色蠶品種的幼蟲血、蛹血的CAT、SOD活力的測定 幼蟲血的收集:于5齡第4天分別對黃白限(雌)、黃白限(雄)、大造、沔赤的幼蟲各隨機抽取5頭蠶，剪去幼蟲的腹足采血(加入少許苯基硫脲)，將幼蟲的血液在4℃，15 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液置于－40℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

蛹血的收集:在蠶化蛹后的第5天，分別將黃白限(雌)、黃白限(雄)、大造、沔赤的蠶蛹置于冰浴條件下剪破蛹的翅部，將蠶蛹的血液滴入預加微量苯基硫脲的1.5 mL離心管中，于－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

幼蟲血、蛹血的SOD、CAT活力的測定:分別按照CAT、SOD試劑盒說明書，對提取的黃白限(雌)、黃白限(雄)、大造、沔赤的幼蟲血、蛹血CAT、SOD的活力進行檢測。

1.3 酶活力的計算公式

蠶卵CAT活力計算公式:

公式①中OD1為240 nm處零時吸光度，OD2為240 nm處1 min時吸光度，2.303為從自然對數(shù)換算成常用對數(shù)時的常數(shù)。CAT的酶活力單位定義:每克組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的CAT相對量為1個CAT活力單位(U)。

蠶卵SOD活力計算公式:

公式②中SOD的酶活力單位定義:每毫克組織蛋白中抑制率表達50%時對應(yīng)的SOD量記為1個SOD活力單位(U)。

蠶血、蛹血CAT的計算公式:

公式③中的271為斜率的倒數(shù)。H2O2的酶活力單位定義:每毫升樣本將每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為1個活力單位(U)。

蠶血、蛹血總SOD活力計算公式:

酶活力單位定義:每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率為50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和F1代蠶卵蛋白的CAT活力

用磷酸緩沖液提取蠶卵蛋白，測定親本和F1代的CAT活力，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，家蠶親本新九、黃白限的CAT活力值分別是41.76、13.34 U/g。其中新九蠶卵蛋白的CAT活力值最高，與F1代新九×黃白限、黃白限×新九蠶卵蛋白的CAT活力值差異大。F1代新九×黃白限的CAT活力值最低(11.13 U/g)，低于雙親的CAT活力值。F1代黃白限×新九的CAT活力值為26.89 U/g，在雙親值之間。

圖1 親本和F1代蠶卵蛋白的CAT活力

2.2 親本和F1代蠶卵蛋白的SOD活力

測定家蠶親本、F1代蠶卵蛋白的SOD活力，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，家蠶親本新九、黃白限蠶卵蛋白的SOD活力值分別為15.54 U/g和14.57 U/g。F1代正交新九×黃白限蠶卵蛋白的SOD活力值為15.26 U/g，F(xiàn)1代反交黃白限×新九蠶卵蛋白的SOD活力值為14.61 U/g，由此看來F1代蠶卵蛋白的SOD活力值是在雙親之間，即，新九＞新九×黃白限 ＞黃白限×新九＞黃白限，但親本和F1代蠶卵蛋白的SOD活力值差異不大。

圖2 親本和F1代蠶卵蛋白的SOD活力

2.3 不同繭色蠶品種幼蟲血、蛹血的CAT活力

測定家蠶不同繭色蠶品種的5齡第5天幼蟲血和第5天蛹血的CAT活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，不同繭色蠶品種黃白限(雌，黃色繭)、黃白限(雄，白色繭)、大造(綠色繭)、沔赤(紅色繭)的5齡第5天幼蟲血的 CAT活力值分別為52.21、78.50、42.50、25.5 U/μL，第5 天蛹血的 CAT活力值分別為 77.75、104.97、60.60、54.50 U/μL。檢測結(jié)果表明，不同繭色蠶品種間的5齡第5天幼蟲血和第5天蛹血的CAT活力值相差較大;同一品種的5齡第5天蠶血和第5天蛹血的CAT活力也相差較大，第5天蛹血的CAT活力值明顯高于5齡第5天幼蟲血的CAT活力值;同一品種黃白限的雌雄間也有較大差異。

圖3 不同繭色蠶品種幼蟲血、蛹血的CAT活力

2.4 不同繭色蠶品種幼蟲血、蛹血的SOD活力

測定家蠶不同繭色品種的5齡第5天幼蟲血和第5天蛹血的SOD活力，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，SOD活力在不同繭色蠶品種的5齡第5天幼蟲血中為黃白限(黃色繭)18.39 U/mL、黃白限(白色繭)29.15 U/mL、大造(綠色繭)20.01 U/mL、沔赤(紅色繭)22.29 U/mL;SOD活力在不同繭色蠶品種第5天蛹血中為黃白限(黃色繭)21.02 U/mL、黃白限(白色繭)20.01 U/mL、大造(綠色繭)20.44 U/mL、沔赤(紅色繭)20.72 U/mL。從圖4還可以看出，SOD活力在不同繭色蠶品種間有差異，在雌雄間(黃白限品種)也有差異;同一品種的5齡第5天幼蟲血與第5天蛹血的SOD活力雖有差異，但差別不大。

圖4 不同蠶品種的蠶血、蛹血的SOD活力

3 小結(jié)與討論

3.1 親本和F1代蠶卵的SOD、CAT活力

本實驗對親本(新九、黃白限)和F1代(新九×黃白限、黃白限×新九)蠶卵的SOD、CAT活力檢測與分析結(jié)果表明，一代雜交種蠶卵的SOD活力是在雙親之間，這與劉春等［4］的研究結(jié)果相一致。對蠶卵的CAT活力測定分析表明，一代雜交種的蠶卵CAT活力與親本的蠶卵蛋白CAT活力有很大的差異，一代雜交種正交蠶卵的CAT活力低于雙親，而反交蠶卵的CAT活力在雙親之間。

3.2 不同繭色蠶品種幼蟲血、蛹血的SOD和CAT活力

對不同繭色蠶品種［黃白限(雌，黃色繭)、黃白限(雄，白色繭)、大造(綠色繭)、沔赤(紅色繭)］的5齡第5天幼蟲血和第5天蛹血進行SOD活力檢測的結(jié)果表明，在本測試的蠶品種中，不同繭色的蠶品種的5齡第5天幼蟲血和第5天蛹血的SOD活力幾乎差異不大，雌蛹血的SOD活力與雄蛹血的SOD活力差異也不大;同一品種的5齡第5天幼蟲血與第5天蛹血的SOD活力雖有差異但差別不大。不同繭色蠶品種間的5齡第5天幼蟲血和第5天蛹血的CAT活力值相差較大，第5天蛹血的CAT活力值明顯高于5齡第5天幼蟲血的CAT活力值，同一品種黃白限的雌雄間也有較大差別。

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