家蠶胚胎滯育的生理生化研究概述

解鴻青，李曉童，沈張飛，朗明紫，陳亞潔，李建琴，占鵬飛，費建明，時連根＊

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000）

滯育（diapause）是指昆蟲在個體發(fā)育的某個特定階段主動停止發(fā)育的現(xiàn)象，它不僅顯著提高了昆蟲抗逆性，使自身的生活周期與取得食物的季節(jié)變化相一致，從而有利于昆蟲個體度過環(huán)境惡劣的季節(jié)，而且促使種群內(nèi)不同個體發(fā)育整齊，有利于交配繁衍后代，所以滯育是昆蟲一種重要的生存策略［1］。家蠶（Bombyx mori）滯育發(fā)生于胚胎發(fā)育早期，是典型的卵滯育昆蟲。每代都發(fā)生滯育的為一化性（univoltine），每代均不發(fā)生滯育的為多化性（polyvoltine），介于兩者之間，高溫（25℃）明催青時發(fā)生滯育，低溫（15℃）暗催青時不發(fā)生滯育的為二化性（bivoltine）［2，3］。大量研究表明，蛹期由咽下神經(jīng)節(jié)（SG）合成和分泌的大量滯育激素（d H）作用于卵巢，決定了產(chǎn)下的蠶卵滯育［4］。滯育性卵產(chǎn)下后經(jīng)過滯育發(fā)動就成為滯育卵，即時浸酸處理可阻止滯育發(fā)動。滯育蠶卵在25℃中可長期維持滯育狀態(tài)，經(jīng)歷秋冬季自然低溫或長期人工低溫處理可解除滯育［5］。長期以來，國內(nèi)外學(xué)者對家蠶胚胎滯育的生理生化變化進行了系統(tǒng)研究，取得了積極進展，本文對此研究概況進行了闡述。

1 家蠶滯育卵的H2O2處于低水平

H2O2是生物體內(nèi)常見的一種活性氧分子，自由基生物學(xué)研究結(jié)果表明，其主要由呼吸電子傳遞滲漏和相關(guān)酶催化的氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生，并被過氧化氫酶（Catalase，CAT）催化所清除［6］。已知H2O2可以通過細胞信號傳導(dǎo)途徑和修飾轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)細胞代謝和基因表達，細胞的分裂、增殖需要高水平的H2O2，但過高水平的H2O2卻會誘導(dǎo)細胞凋亡或殺死細胞［7］。近年來研究家蠶H2O2代謝與滯育的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在滯育發(fā)動階段，蠶卵H2O2處于低水平，負責清除H2O2的CAT活性急劇升高，并在產(chǎn)后4 d達到峰值［8］；在蠶卵產(chǎn)下后24 h，用外源H2O2處理以提高蠶卵內(nèi)H2O2水平，可以有效阻止蠶卵的滯育發(fā)動，使蠶卵不再進入滯育［9］；如果先用CAT專一性抑制劑3-氨基三唑（3-amino-1，2，4-triafol，AT）處理蠶卵，以降低蠶卵CAT活性后，再用H2O2處理，則可顯著提高阻止蠶卵滯育發(fā)動的有效性［10］；經(jīng)過H2O2處理的蠶卵，將進入一種特殊狀態(tài)的滯育，這種滯育卵可以隨時被HCI處理而解除滯育，用H2O2和HCI的混合液解除滯育的效果更好［11］。在即時浸酸阻止滯育發(fā)動時，蠶卵CAT活性受到極顯著的抑制，只有對照組的1/5，而H2O2水平升高2～3倍，略高于同期非滯育卵，從而阻止滯育發(fā)動，使蠶卵胚胎向前發(fā)育達到孵化［12］。滯育卵產(chǎn)后4 d，胚胎細胞停止分裂，胚胎進入滯育維持階段，CAT活性迅速下降后處于低水平，H2O2維持于低水平。解除了滯育的蠶卵在催青期用水處理，則孵化率顯著下降，但在水中添加H2O2，可以顯著提高水處理蠶卵的孵化率［13］。5℃冷藏處理滯育蠶卵，蠶卵H2O2水平在初期有一小幅降低后逐漸升高，在第50 d（滯育解除）達峰值［14］。已解除滯育的二化性蠶卵分別用25℃明催青和15℃暗催青，蠶卵體內(nèi)H2O2水平在25℃明催青中后期呈U型變化，CAT活性在催青后期迅速上升，但蠶卵體內(nèi)H2O2水平在15℃暗催青第16 d出現(xiàn)峰值，CAT活性在催青后期緩慢上升；幼蟲體內(nèi)H2O2水平，兩種催青處理的基本相似，均是隨齡期增加而逐步下降，CAT活性在1～4齡逐步下降，而在5齡期有所回升；蛹體內(nèi)H2O2水平，25℃明催青的分別在第2 d和第9 d出現(xiàn)峰值，CAT活性分別在第3 d和第6 d出現(xiàn)峰值，而15℃暗催的在第4 d出現(xiàn)峰值，CAT活性在第5 d出現(xiàn)峰值［15］。由此可見，H2O2水平在家蠶胚胎滯育的誘導(dǎo)、阻止和解除中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

2 家蠶滯育卵中山梨醇大量積累

山梨醇是一種小分子糖醇，在蠶卵中大量積累可促進胚胎滯育。滯育蠶卵中山梨醇水平，在滯育發(fā)動階段逐步提高，在滯育維持階段升高并保持于很高水平，在滯育解除階段前期仍保持于很高水平，后期則迅速下降；即時浸酸后在短暫升高后迅速下降，滯育發(fā)動被阻止［16］。山梨醇在非滯育卵中不被合成，也不累積，因此是滯育專一的物質(zhì)。但將非滯育蠶卵置于N2中，出現(xiàn)山梨醇大量積累和胚胎細胞分裂停止這類似于滯育的現(xiàn)象，但一旦再轉(zhuǎn)入新鮮空氣中，山梨醇水平迅速下降，胚胎細胞分裂迅速恢復(fù)［17］。Horie等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，將脫殼滯育蠶卵放入Grace液中培養(yǎng)時，其滯育被解除，并能正常發(fā)育成蟻蠶，但在Grace液中大量添加山梨醇時，脫殼滯育蠶卵和非滯育蠶卵的胚胎發(fā)育均受阻，認為滯育蠶卵中大量積累的山梨醇抑制了胚胎發(fā)育，脫殼后培養(yǎng)于Grace液中時，由于山梨醇被稀釋而失去抑制作用［18］。山梨醇大量積累不僅促進家蠶胚胎滯育，還可以降低蠶卵自由水含量，從而降低蠶卵過冷點并保護細胞膜與生物大分子，這有利于滯育蠶卵越冬。滯育蠶卵中大約含有150 mmol/L山梨醇，可降低過冷點0.342℃，可見山梨醇積累對蠶卵越冬具有重要意義。

3 家蠶滯育卵中缺乏葡萄糖

蠶卵產(chǎn)下后約1 d形成卵黃細胞，卵黃細胞分解糖原產(chǎn)生葡萄糖。卵黃細胞中葡萄糖可在NAd P-多元醇脫氫酶催化下被NAd PH還原成山梨醇，山梨醇又可在NAd-山梨醇脫氫酶（sorbitol d ehyd rogenase，Sd H）催化下脫氫生成果糖和NAd H，果糖可進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖后重新用于糖原合成或者進入糖酵解。非滯育蠶卵中Sd H基因高效表達，所以非滯育蠶卵中不積累山梨醇，卵黃細胞分解產(chǎn)生的葡萄糖除部分用于卵黃細胞自身代謝外，大部分源源不斷地運輸?shù)脚咛ゼ毎ＷC胚胎發(fā)育順利進行［19］。而滯育蠶卵中Sd H基因不表達，生成的山梨醇大量積累，同時葡萄糖被持續(xù)消耗，使卵黃細胞一方面提高糖原磷酸化酶活性以加強糖原降解，另一方面大大減少了葡萄糖外運，從而造成胚胎細胞因為葡萄糖缺乏而呼吸作用顯著下降，細胞分裂增殖停止，促使胚胎進入滯育［20］。滯育蠶卵即時浸酸后12 h，Sd H開始表達，約1 d后山梨醇水平顯著下降，葡萄糖水平上升，滯育發(fā)動被阻止；5℃低溫冷藏處理滯育蠶卵，在第40 d Sd H基因開始表達，山梨醇水平下降，葡萄糖供應(yīng)恢復(fù)，胚胎細胞呼吸作用恢復(fù)正常，滯育狀態(tài)被解除［21］。將非滯育蠶卵置于N2中時，由于NAd H不能再生為NAd+，山梨醇脫氫反應(yīng)被阻止，山梨醇大量積累，葡萄糖供應(yīng)停止，從而造成胚胎發(fā)育停止；此時再將卵轉(zhuǎn)入空氣中，隨著O2供應(yīng)恢復(fù)，NAd H再生為NAd+，山梨醇脫氫反應(yīng)正常進行，山梨醇水平顯著下降，葡萄糖供應(yīng)恢復(fù)，胚胎發(fā)育又正常進行［17］。由此可見，滯育蠶卵由于山梨醇大量積累而競爭性地造成葡萄糖缺乏，最終導(dǎo)致家蠶胚胎滯育。

4 家蠶滯育卵的呼吸耗氧量下降

呼吸作用處于新陳代謝的中樞，一方面提供了各種生命活動所需能量，另一方面提供了生物合成所需底物和還原力。呼吸作用持續(xù)處于極低水平時，細胞代謝和分裂增殖將受到抑制。非滯育蠶卵自產(chǎn)下至孵化，呼吸耗氧量逐步升高；滯育蠶卵在產(chǎn)下約1 d開始滯育發(fā)動時，呼吸耗氧量突然急劇下降，產(chǎn)下3 d時的呼吸耗氧量下降到產(chǎn)下1 d時的1/6，相當于非滯育卵產(chǎn)下3 d時的1/10，產(chǎn)下4 d時的呼吸耗氧量進一步下降后維持于極低水平，胚胎細胞停止分裂而進入滯育維持階段；滯育蠶卵在長期低溫處理以解除滯育的過程中，呼吸耗氧量保持于極低水平，到滯育解除時迅速上升［22］。Sonobe等（1991）研究滯育蠶卵呼吸耗氧量下降的原因，發(fā)現(xiàn)滯育性蠶卵卵殼的O2透過性顯著低于非滯育性蠶卵，但是滯育蠶卵卵殼O2透過量遠遠超過呼吸作用對O2的需要量，并且滯育發(fā)動前后和滯育解除前后都未見卵殼O2透過性發(fā)生顯著變化，即滯育蠶卵呼吸耗氧量下降并不是卵殼阻止外界O2進入而造成的［23］。柳沼利信等（1997）認為滯育蠶卵呼吸耗氧量下降的原因可能在于蠶卵內(nèi)部代謝［24］，王啟龍等（2013）研究發(fā)現(xiàn)NAd＋降解增強和NAd＋再生下降是共同導(dǎo)致滯育蠶卵呼吸耗氧量下降的因素之一［25］。呼吸耗氧量的降低或升高，決定著蠶卵進入或解除滯育，但有關(guān)滯育性蠶卵呼吸耗氧量下降與提高的原因，還需要通過對滯育性蠶卵不同發(fā)育階段呼吸作用相關(guān)酶活性的系統(tǒng)檢測與分析，才能得出全面、完整的結(jié)論。