響應面法優(yōu)化枇杷花黃酮提取工藝研究

謝田偉，陳發(fā)河，吳光斌

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

響應面法優(yōu)化枇杷花黃酮提取工藝研究

謝田偉，陳發(fā)河，吳光斌

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

采用超聲波輔助提取法對枇杷花黃酮的提取工藝進行了研究．在單因素實驗的基礎上，采用四因素三水平的響應面法優(yōu)化枇杷花黃酮提取工藝條件．結果表明，枇杷花黃酮提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)為64%，料液比為1∶44(g∶mL)，超聲溫度為59℃，超聲時間為38 min．在此條件下，枇杷花黃酮得率為106.422 mg/g．

枇杷花;黃酮;超聲波輔助;響應面

0 引言

枇杷花，又名土冬花，具有“止渴下氣、利肺、止吐逆、去焦熱、潤五臟、治頭風”等功效［1］．現(xiàn)代藥理研究表明，枇杷花在抑菌、抗炎、止咳、鎮(zhèn)痛、平喘、祛痰等方面有顯著效果［2］．有研究報道，枇杷花的藥理作用與其含有較多的黃酮類化合物密切相關［3］，枇杷花黃酮類化合物具有一定的止咳、抗炎作用［4］．目前，黃酮類化合物的提取方法主要有水和溶劑浸提法［5－6］、堿液提取法［7］、超聲波法［8－9］、微波輔助提取法［10－11］、超臨界流體萃取法［12－13］、酶解法［14－15］等．超聲波輔助法由于超聲波在提取溶劑中產生空化效應、機械作用、攪拌作用，破壞植物細胞，使黃酮類化合物溶入溶劑中，同時傳遞能量給植物和溶劑，加速細胞內黃酮類化合物的溶解和釋放，從而加速黃酮類化合物的浸出．該法具有提取率高、提取時間短、有效成分不易變性等優(yōu)點［16－18］，因此，近年來該方法作為提取天然植物中黃酮類化合物的新手段被廣泛應用．目前對枇杷花的開發(fā)利用主要集中在枇杷花茶的加工，其他有諸如枇杷花醋［19］、枇杷花酒及蜜酒［20］、枇杷花露［21］、蜜煉枇杷膏［22］等產品以及枇杷花總皂苷［23］及用于治療咽炎的枇杷花提取物［24］等．為充分利用枇杷花資源，提高枇杷花的利用價值，有必要對枇杷花主要活性成分黃酮的提取工藝進行優(yōu)化研究．本文通過研究超聲波輔助提取枇杷花黃酮工藝，在單因素實驗的基礎上，對影響枇杷花黃酮得率的溶劑濃度、料液比、超聲溫度和超聲時間等因素進行初步研究，再采用Box－Behnken中心組合設計原理，響應面法優(yōu)化枇杷花黃酮提取工藝，以期獲得最佳工藝參數(shù)．

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

枇杷花采自福建云霄，蘆丁對照品 (中國藥品生物制品鑒定所)，無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等藥品均為分析純．

KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);FW100高速萬能粉碎機 (天津市泰斯特儀器有限公司);UV－2600A型紫外可見分光光度計 (尤尼柯上海儀器有限公司);RE－52AA旋轉蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠);HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 (國華電器有限公司);SHB－Ⅲ循環(huán)水式真空泵 (鄭州長城科工貿有限公司);電子天平 (梅特勒－托利多食品 (上海)有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 將曬干的枇杷花去除枝干，粉碎后放入保鮮袋中，于干燥皿中保存．

1.2.2 標準溶液的制備和標準曲線的確定 精確稱取蘆丁標準品20 mg，用體積分數(shù)40%乙醇溶解于100 mL容量瓶中，定容，搖勻，制得質量濃度為206.5 mg/L的蘆丁對照品溶液．精確移取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL上述對照品溶液置于10 mL容量瓶中，進行編號．加質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min;再加質量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加質量分數(shù)為4%的NaOH溶液4 mL，搖勻放置15 min后，用體積分數(shù)為40%的乙醇定容．以同法配制空白對照，在510 nm波長處測定吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，并作線性回歸，得蘆丁濃度C和吸光度值A的標準曲線線性回歸方程．

1.2.3 枇杷花中黃酮的提取及測定 精確稱取0.5 g枇杷花粉末，以乙醇溶液為溶劑，在一定條件下進行超聲輔助浸提，浸提液經抽濾后，加入相應濃度的乙醇定容于50 mL待測．精確吸取0.5 mL提取液于10 mL容量瓶中，按1.2.2方法測提取液中黃酮的含量，再下式計算枇杷花提取黃酮得率:黃酮得率(mg/g)=提取得到的黃酮質量(mg)/枇杷花質量(g)．

1.2.4 試驗設計 在單因素實驗的基礎上，對乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間等4個影響枇杷花黃酮得率的因素進行優(yōu)化實驗．采用Box－Behnken方法，響應面因素水平編碼表如表1所示．

表1 響應面分析因素和水平表Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

繪制的蘆丁標準曲線如圖1所示，濃度ρ與吸光度值A之間關系的回歸方程為:A=0.010 2ρ－0.009 6，相關系數(shù)R2=0.999 7，說明在2.065～103.250 mg/L范圍內，溶液濃度與吸光度值有良好的線性關系．

2.2 單因素實驗結果及其分析

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對枇杷花黃酮得率的影響

固定料液比為1∶30(g∶mL)，提取溫度為60℃，提取時間為40 min，選取體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%乙醇進行提取，其提取結果如圖2所示．

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

圖2 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the ethanol concentration on extraction ratio of flavonoids

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，提取液中黃酮得率先增大，但當乙醇體積分數(shù)達到60%時，枇杷花黃酮得率達到峰值，而后黃酮得率又隨著乙醇體積分數(shù)的增大而呈現(xiàn)下降趨勢．分析其原因，可能是由于乙醇體積分數(shù)是影響乙醇和黃酮間親和力的一種因素，而60%的乙醇和黃酮間親和力最大，溶解性最好．而一旦乙醇體積分數(shù)過高時極性發(fā)生改變，使提取液中的一些脂溶性物質溶出增加，從而影響了總黃酮的浸出．綜合考慮，選取60%乙醇溶液進行后續(xù)實驗．

2.2.2 料液比對枇杷花黃酮得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)為60%，提取溫度為60℃，提取時間為40 min，選取料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g∶mL)進行提取，提取結果如圖3所示．由圖3可知，隨著料液比的升高，枇杷花總黃酮得率也不斷增加，但當料液比達到1∶30(g∶mL)時，繼續(xù)增大料液比，黃酮得率并沒有增大，反而有所下降．這可能是由于隨著料液比的增加，枇杷花中的黃酮溶出量逐漸增加，但當提取溶劑量達到一定程度時，枇杷花中的黃酮已基本溶出，而過多的提取溶劑，使得提取液中脂溶性物質溶出量增大，對黃酮提取工作的影響增大．同時溶劑量過大，不利于降低生產成本和之后的濃縮工作量．所以，綜合考慮，料液比為1∶30(g∶mL)較適宜．

圖3 料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction ratio of flavonoids

2.2.3 超聲時間對枇杷花黃酮得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶30(g∶mL)，提取溫度為60℃，選取提取時間分別為20、30、40、50、60 min進行提取，其提取結果如圖4所示．由圖4可知，隨著時間的延長，黃酮得率在逐漸增大，在40 min時達到最大，之后隨著提取時間的延長，黃酮得率呈現(xiàn)下降的趨勢．原因可能是當時間過短時，枇杷花黃酮提取不夠充分，沒有完全溶出，而時間過長，又可能引起黃酮結構的一些變化進而使黃酮得率降低，故枇杷花黃酮適宜的提取時間為40 min．

2.2.4 超聲溫度對枇杷花黃酮得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶30(g∶mL)，提取時間為40 min，選取提取溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃、75℃進行提取，其提取結果如圖5所示．由圖5可知，隨著提取溫度的升高，黃酮得率逐漸增大，但當溫度升到60℃時，再提高提取溫度，黃酮得率略有下降．可能是由于原料受熱使枇杷花中一些黃酮類化合物發(fā)生氧化而被破壞，且溫度過高導致溶劑揮發(fā)損失，同時溫度過高使枇杷花中其他成分的溶解度增大，從而使黃酮得率有所下降．綜合考慮，提取溫度選取60℃比較適宜．

圖4 超聲時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extracting time on the ratio of flavonoids

圖5 超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction ratio of flavonoids

2.2.5 超聲輔助提取法和乙醇浸提法對枇杷花黃酮得率的影響

以體積分數(shù)60%乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1∶30(g∶mL)，在60℃的恒溫水浴中浸提2 h，乙醇浸提法得到黃酮得率為91.041 mg/g;其他條件相同，280 W超聲波超聲提取40 min，超聲輔助提取法得到黃酮得率102.094 mg/g，超聲波法的提取效果比乙醇浸提法提高了12.14%．在其他提取條件相同的前提下，超聲波法提取時間僅需40 min，與傳統(tǒng)浸提法相比，具有省時、提取率高、設備簡單等優(yōu)點．

2.3 響應面實驗結果與分析

2.3.1 響應面實驗結果

Box－Behnken中心組合試驗設計以及實驗結果如表2所示．通過Design Expert 7.0軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析，得到以下回歸方程:y=276．48371+3．19886a－2.28722b － 7．17210c － 0．53878d+0．042030ab － 0．031266ac+0．025978ad+0．012988bc+0.004147bd－ 0．017562cd －0．033086a2－0．014787b2+0．078044c2－0．003351d2．其中:y為黃酮得率 (mg/g);a為乙醇體積分數(shù) (%);b為料液比 (g∶mL);c為超聲溫度 (℃);d為超聲時間 (min)．

P水平是檢驗回歸系數(shù)的標準，P＜0.05、P＜0.01和P＞0.05分別表明回歸方程顯著、極顯著和不顯著［25］．由表3可知，A(乙醇體積分數(shù))、B(料液比)、D(超聲時間)對Y(黃酮得率)影響極顯著，而C(超聲溫度)不顯著，AB、AC項P＜0.01，說明乙醇體積分數(shù)和料液比、乙醇體積分數(shù)和超聲溫度兩因素間的交互作用影響極顯著，AD項P＜0.05，說明乙醇體積分數(shù)和超聲時間兩因素間的交互作用影響顯著，而其他因素間交互影響均不顯著．

從整體分析，該回歸模型F檢驗極顯著(P＜0.01)，其失擬項檢驗P=0.062 6＞0.05，不顯著，表明該模型與實際情況擬合程度較好，可用此模型對試驗進行分析和預測．其決定系數(shù)R2=0.949 8，說明預測值和實測值之間具有高度相關性，響應值的變化有94.98%與所選變量相關，僅有10.03%的變異不能由該模型解釋(=0.899 7)，變異系數(shù)為1.90%，說明實驗有較好的精確度和可靠性，可以用該回歸方程代替真實試驗點對試驗結果進行分析和預測．因此，此模型能較好地描述各因素與響應值之間的關系，可用此模型對枇杷花黃酮得率進行分析預測．

表2 響應面試驗方案和結果Tab.2 The plan and results for response surface methodology

2.3.2 黃酮得率的方差分析

對得到的多元二次回歸模型進行方差分析，方差分析結果及模型系數(shù)顯著性如表3所示．

2.4 枇杷花黃酮提取的響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸模型預測各因素對黃酮得率的影響如圖6所示．圖6的6組圖分別顯示了不同交叉因素對黃酮得率的交互作用影響趨勢，響應面圖根據(jù)曲面的傾斜程度來反映兩因素交互作用的顯著程度，當曲面越陡，交互作用越顯著，而曲面越光滑，交互作用就越?。蓤D6b可知，當浸提溫度為50℃時，黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增大，超聲溫度與乙醇體積分數(shù)間有簡單的線性關系，但隨著溫度的升高，這種簡單的線性關系被破壞，而當溫度達到60℃時，乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響大大減弱．圖6c為料液比為1∶30(g∶mL)、超聲溫度為60℃時，乙醇體積分數(shù)和超聲時間兩因素的交互作用，可知其交互作用顯著．在較低的因子水平時，隨著乙醇體積分數(shù)和超聲時間的增大，黃酮得率逐漸升高．但當固定乙醇體積分數(shù)時，黃酮得率隨著超聲時間的延長先上升后下降;而當固定超聲時間時，枇杷花黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的增大同樣呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，這兩種變化均與單因素實驗分析的結果是一致的．因此，通過對各因素交互作用影響的響應面圖和等高線圖的分析，可以直觀地判斷各因素間的交互作用顯著程度以及各單因素的變化趨勢．

由SAS典型性分析知，四因素的特征值有正有負，表明二次響應面為鞍面，無極值存在．通過嶺脊分析得到最大響應值時A、B、C、D對應的編碼值分別為0.361491、1.448172、－0.069884、－0.168775，轉化為非編碼值分別為63.614907、44.481717、59.301162、38.312252．考慮實際操作的局限性，將各因素理論值修正為:乙醇體積分數(shù)為64%，料液比為1∶44(g∶mL)，超聲溫度59℃，超聲時間38 min．而模型預測枇杷花黃酮得率為104.384 mg/g．在此最優(yōu)條件下進行驗證實驗，3次平行實驗測得黃酮得率分別為:108.702、106.763、103.802 mg/g，3次取平均值為106.422 mg/g，與理論預測值誤差為1.9%，驗證了模型能較好地預測實際黃酮得率．

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 Variance analysis of the regression equation

3 結論

通過中心組合試驗設計和響應面分析法考查乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間及提取溫度對枇杷花黃酮得率的影響，得到枇杷花黃酮超聲波輔助提取工藝的多元二次回歸模型:y=276．48371+3.19886a － 2．28722b － 7．17210c － 0．53878d+0．042030ab － 0．031266ac+0．025978ad+0．012988bc+0．004147bd － 0．017562cd － 0．033086a2－ 0．014787b2+0．078044c2－ 0．003351d2．其中:y為黃酮得率 (mg/g);a為乙醇體積分數(shù) (%);b為料液比 (g∶mL);c為超聲溫度 (℃);d為超聲時間(min)．

方差分析結果表明，該模型F檢驗極顯著，其失擬項檢驗不顯著，決定系數(shù)R2為0.9498，表明該模型能較好地預測枇杷花黃酮得率隨各因素變化的規(guī)律．

圖6 各因素及其交互作用對黃酮得率的影響Fig.6 The effect of various factors and interaction on flavonoids ratio

響應面法優(yōu)化得到枇杷花黃酮提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)為64%，料液比為1∶44(g∶mL)，超聲溫度59℃，超聲時間38 min．在此條件下，枇杷花黃酮提取量為106.422 mg/g，與理論預測值誤差僅為1.9%，表明該模型能較好地預測枇杷花實際黃酮得率．響應面法能較好地優(yōu)化枇杷花黃酮的超聲波輔助提取工藝．

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(責任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰)

Optimization of Extraction Technology of Flavonoids from Loquat Flower by Response Surface Methodology

XIE Tian-wei，CHEN Fa-he，WU Guang-bin
(College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

Ultrasonic-assisted extraction method was used to investigate the extraction of flavonoids from loquat flower．The method of response surface analysis with four factors and three levels was adopted to optimize the extraction conditions of flavonoids on the basis of single-factor experiment．The results showed that optimal conditions for extraction of flavonoids could be reached using 64%ethanol as extraction solvent with solid and liquid ratio 1∶44(g∶mL)at 59 ℃ for 38 minutes．Under these conditions，the yield of flavonoids from loquat flower was 106.422 mg/g．

loquat flower;flavonoids;ultrasonic-assisted;response surface methodology

TS 209

A

1007－7405(2012)05－0343－08

2012－05－14

2012－06－11

國家自然科學基金資助項目 (31171777);廈門市科技計劃項目 (3502Z20103024)

謝田偉 (1985—)，男，碩士生，從事農產品加工技術方向研究．通訊作者:陳發(fā)河 (1960—)，男，教授，從事農產品貯藏與加工方向研究，E-mail:fhchen@jmu．edu．cn．