人工感染呼腸孤病毒對擬穴青蟹部分免疫因子的影響

鄒 清，李君華，朱小明

(1.廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，福建廈門361005;2.國家海洋局溫州海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，浙江溫州325000;3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺264003)

人工感染呼腸孤病毒對擬穴青蟹部分免疫因子的影響

鄒 清1，2，李君華1，3，朱小明1

(1.廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，福建廈門361005;2.國家海洋局溫州海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，浙江溫州325000;3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺264003)

采用注射和浸泡的方式人工感染擬穴青蟹呼腸孤病毒，研究了其對擬穴青蟹血細胞密度以及血清中酚氧化酶 (PO)、超氧化物歧化酶 (SOD)和堿性磷酸酶 (AKP)活力的影響.結(jié)果表明:注射(第Ⅱ組)和浸泡 (第Ⅳ組)方式均能感染健康青蟹，病發(fā)死亡時間為7～9 d，死亡率達100%，血細胞平均密度在試驗36～72 h間迅速上升并達最高值，其血細胞密度最高值分別為1.4008×107cells/mL與1.8243×107cells/mL;感染病毒的青蟹PO活性均大致呈現(xiàn)下降的趨勢，其中，第Ⅳ組感染12 h青蟹PO活性相對對照組顯著升高(P＜0.05)，其值為(6.90±1.54)，達實驗所測PO活性最高值;各實驗組血清SOD活性呈無規(guī)律的變化;AKP活性感染組與對照組表現(xiàn)不同.表明測定血細胞密度以及PO和AKP活性可用來輔助診斷青蟹疾病，而SOD活性變化不能很好地表征青蟹受病毒感染的狀況.

擬穴青蟹;呼腸孤病毒;免疫因子

0 引言

擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國東南沿海重要的養(yǎng)殖蟹類之一.近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，各種疾病頻繁暴發(fā)，已造成嚴重損失.蟹類病毒病的研究已經(jīng)成為關(guān)注的焦點［1－3］，國內(nèi)蟹類病毒病的研究主要集中在中華絨鰲蟹上，而針對擬穴青蟹病毒病的研究近幾年才有部分報道［4－6］.

蟹類不具備獲得性免疫，僅有天然免疫，其生理防御體系主要由血細胞和體液中多種免疫因子所構(gòu)成，機體受到病原生物入侵自然會產(chǎn)生相應的免疫應答，如血細胞的組成和密度，血清中相關(guān)酶活性等會發(fā)生相應變化.文獻［6］報道在漳州龍海和廈門同安青蟹養(yǎng)殖場所取病蟹樣品中分離出一株球狀病毒.本文擬在此基礎(chǔ)上，進行人工感染實驗，測定血細胞密度和血清中酚氧化酶 (PO)、超氧化物歧化酶 (SOD)和堿性磷酸酶 (AKP)的活性，用以輔助診斷青蟹疾病，并通過這些相關(guān)指標的變化了解實驗青蟹在感染病毒時的生理反應情況，判斷病毒的致病性以及致病途徑、過程和時間，為疾病的防治提供重要理論依據(jù)，促進青蟹養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定、持續(xù)的發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 實驗材料及飼養(yǎng)條件

患病瀕死的擬穴青蟹取自漳州龍海和廈門同安部分養(yǎng)殖場，帶回實驗室于－70℃保存待用.健康青蟹購于廈門第八市場，所選青蟹體色鮮艷，無病無傷，平均體重(106.9±12.2)g，飼養(yǎng)于容積100 L水箱中，每箱10～15只，整個飼養(yǎng)過程在弱光條件下進行，微充氣，以新鮮菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)投喂，日換水約1/3，及時清除殘餌、糞便和因運輸及環(huán)境變化造成的死亡個體，7 d后開始實驗，整個實驗過程中，水溫19～23℃，鹽度28～30，pH=6.8.

1.2 實驗方法

1.2.1 感染液的制備

感染液Ⅰ:配制0.85%的生理鹽水，高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆?感染液Ⅱ:解剖病蟹，取出肝胰腺、性腺、肌肉、鰓等各種組織器官共5 g，加入10 mL磷酸緩沖液，冰水浴中勻漿，3000 r/min、4℃離心20 min，取中層清液，8000 r/min、4℃離心30 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾，所得濾液即病蟹組織粗提液，4℃保存?zhèn)溆?感染液Ⅲ:健康青蟹組織粗提液按病蟹組織粗提液的制備方法制備;感染液Ⅳ:病蟹所剩組織器官加入一定比例的磷酸緩沖液，冰水浴中勻漿，8000 r/min、4℃離心30 min，取中層清液，所得組織液4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 人工感染

實驗一:第Ⅰ組，注射無菌生理鹽水 (0.2 mL/mg)，于第4步足基部向體腔內(nèi)注射，此組作為對照組;第Ⅱ組，注射病蟹組織粗提液 (感染液Ⅱ)，注射方法和劑量與第Ⅰ組相同;第Ⅲ組，注射健康青蟹組織粗提液 (感染液Ⅲ)，注射方法和劑量與第Ⅰ組相同;第Ⅳ組，感染液Ⅳ用海水稀釋200倍，實驗青蟹浸入其中，12 h后移入實驗水箱.以上各組青蟹分別用2個水箱飼養(yǎng)，每箱5只，記錄死亡情況，如果第Ⅱ組和第Ⅳ組青蟹全部死亡，仍繼續(xù)觀察待實驗結(jié)束.

實驗二:各組青蟹感染方式同實驗一，每組30只，分成3個箱飼養(yǎng).從實驗開始，分別于第12、36、72、108、144 h從每箱各取1只蟹，采用斷肢法收集血淋巴.

1.2.3 樣品制備

取0.1 mL血淋巴加入等量抗凝劑 (0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L葡萄糖，0.03 mol/L檸檬酸鈉，0.026 mol/L檸檬酸，0.01 mol/L EDTA，pH=6.4)，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù);其余血淋巴4℃放置24 h后低速離心析出上清液作為血清樣本，－70℃保存待用.

1.2.4 血清酶活性的測定

1)酚氧化酶PO活性的測定

以L－dopa為底物測定PO活性.將0.l mol/L，pH=6.0的磷酸鉀鹽緩沖液3.9 mL與0.0l mol/L的L－dopa 1.0 mL以及100 μL血清于室溫下混勻，30℃孵育5 min，每間隔2 min讀取在490 nm波長下的吸光度值.以試驗條件下每1 min OD490增加0.001定義為一個酶活性單位.

2)超氧化物歧化酶SOD活性的測定

采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定，具體方法按試劑盒說明進行.SOD酶活性定義為每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位.

3)堿性磷酸酶AKP活性的測定

采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定，具體方法按試劑盒說明進行.AKP酶活性定義為，100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在SPSS 11.0數(shù)據(jù)處理軟件上統(tǒng)計平均值、標準差，采用one－way ANOVA系統(tǒng)進行分析.

2 結(jié)果

2.1 人工感染試驗結(jié)果

人工感染實驗在第十六天結(jié)束，實驗結(jié)果見表1.注射病蟹組織粗提液組 (第Ⅱ組)和浸泡病蟹組織粗提液組 (第Ⅳ組)所有青蟹至第九天全部死亡，最早全部死亡的是第Ⅱ組2號箱，感染第六天死亡;第九天時對照組 (第Ⅰ組)2個水箱中青蟹死亡率均為20%，注射健康青蟹組織粗提液組(第Ⅲ組)死亡率分別為20%和40%，此后7 d中以上兩組陸續(xù)還有青蟹死亡，最終死亡率，第Ⅰ組分別為40%和80%，第Ⅲ組分別為100%和60%;各實驗組初次出現(xiàn)死亡的時間有所不同，其中第Ⅳ組為第三天，其余3組可能因采用注射方式處理，對青蟹傷害較大，大部分水箱在實驗第一天均出現(xiàn)死亡.

表1 人工感染試驗結(jié)果Tab．1 Experimental infection of mud crabs with virus extraction

2.2 血細胞密度變化

血細胞密度變化實驗結(jié)果見圖1a.從整體趨勢上看，對照組血細胞密度沒有明顯變化;第Ⅲ組與對照組相比無顯著差異，這兩組青蟹血細胞密度始終維持在比較平穩(wěn)的狀態(tài);而經(jīng)過病蟹組織粗提液處理的第Ⅱ組和第Ⅳ組，血細胞密度呈現(xiàn)急劇上升而后迅速下降的變化趨勢.第Ⅳ組青蟹血細胞密度在第36 h時從5.626×106cells/mL上升至1.4008×107cells/mL，與其他3組差異極顯著(P＜0.01)，此后又繼續(xù)升高，到第72 h達到最高峰，為2.8534×107cells/mL，此刻，第Ⅱ組青蟹血細胞密度也上升到1.8243×107cells/mL的最高值，這兩組與對照組和第Ⅲ組表現(xiàn)出極顯著差異(P＜0.01);從108 h直至實驗結(jié)束，第Ⅱ組和第Ⅳ組血細胞數(shù)量又下降至與對照組和第Ⅲ組無顯著差異的水平.

圖1 各試驗組青蟹生化指標變化Fig.1 Comparison of haemocyte density between the different experimental groups

2.3 PO活性變化

PO活性變化實驗結(jié)果 (如圖1b所示):試驗開始12 h，與對照組相比，第Ⅱ組和第Ⅲ組PO活性沒有顯著差異，第Ⅳ組顯著升高(P＜0.05)，其值為(6.90±1.54)，這是整個實驗中所測PO活性最高值;至36 h，第Ⅳ組PO活力下降，各組沒有顯著差異，此規(guī)律一直持續(xù)到72 h;至108 h，第Ⅲ組和第Ⅳ組PO活性相對對照組顯著降低(P＜0.05)，而第Ⅱ組與對照組沒有顯著差異;至144 h，第Ⅱ組與對照組相比PO活性顯著降低(P＜0.05)，其余兩組與對照組沒有顯著差異.從整體趨勢上看，對照組和第Ⅲ組各時間段沒有明顯差異;而經(jīng)病蟹組織粗提液感染過的第Ⅱ組和第Ⅳ組，青蟹血清PO活性大致呈現(xiàn)下降趨勢，其中第Ⅱ組從12 h至72 h逐漸下降，至108 h略有回升，但沒有明顯差異，至144 h，PO活性相比12 h和108 h顯著降低(P＜0.05);第Ⅳ組，12 h的PO活性相比其他時間段升高極顯著(P＜0.01)，72 h和36 h沒有顯著差異，而108 h和144 h相比36 h顯著降低(P＜0.05).

2.4 SOD活性變化

SOD活性變化實驗結(jié)果見圖1c.12 h時，第Ⅱ組和第Ⅳ組青蟹血清SOD活性相對于對照組和第Ⅲ組顯著降低(P＜0.05);36 h時，第Ⅱ組和第Ⅳ組與對照組差異不明顯，但第Ⅲ組SOD值明顯高于其他3組(P＜0.05);72 h時，第Ⅱ、Ⅲ和第Ⅳ組SOD值相比對照組顯著升高(P＜0.05);至108 h時，這3組與對照組相比，SOD值又有顯著下降(P＜0.05);144 h時，第Ⅱ組相對對照組SOD值顯著降低(P＜0.05)，其他兩組與對照組沒有明顯差異.各組SOD活力值整體變化趨勢:對照組有所起伏，36 h和72 h相比12 h顯著下降(P＜0.05)，108 h和144 h相比前兩次又明顯升高(P＜0.05)，其中108 h與12 h無明顯差異，而144 h SOD值明顯高于12 h(P＜0.05);第Ⅲ組SOD值除第108 h有明顯降低之外(P＜0.05)，其余時間沒有顯著差異;第Ⅱ組72 h SOD值有明顯升高(P＜0.05)，其余時間段沒有明顯差異;而第Ⅳ組變化情況與第Ⅱ組類似，不同的是在實驗最后有顯著升高的過程(P＜0.05).

2.5 AKP活性變化

AKP活性變化實驗結(jié)果見圖1d，12 h時，第Ⅲ組和第Ⅳ組青蟹血清AKP活性相比對照組顯著降低(P＜0.05)，第Ⅱ組和對照組沒有顯著差異;36 h時，第Ⅳ組相比對照組AKP值顯著降低(P＜0.05)，第Ⅱ組和第Ⅲ組與對照組沒有顯著差異;72 h時各組AKP值沒有顯著差異，至108 h，第Ⅱ組和第Ⅳ組比對照組AKP顯著降低(P＜0.05)，第Ⅲ組和對照組沒有明顯差異;144 h時，各組沒有顯著差異.各組變化趨勢:對照組沒有顯著差異，第Ⅳ組各時間段也沒有顯著差異;而第Ⅱ組和第Ⅲ組整個過程有所波動，其中第Ⅱ組108 h時AKP值顯著低于36 h時(P＜0.05)，而第Ⅲ組在108 h時AKP值顯著高于其他各時間段(P＜0.05).

3 討論

目前至少發(fā)現(xiàn)有8種蟹類呼腸孤病毒，均能引起嚴重的疾病并且容易大面積傳播，比如P病毒和RLV病毒感染會引起蟹類反應遲緩、附肢麻痹癱瘓等癥狀;中華絨螯蟹“顫抖病”也主要由呼腸孤病毒引起［3，5，7－13］.青蟹中未發(fā)現(xiàn)有類似明顯癥狀，但青蟹受到呼腸孤病毒感染后附肢自切是較普遍現(xiàn)象.實驗結(jié)果表明，注射和浸泡的方式都能感染青蟹，而且浸泡組的青蟹發(fā)病速度幾乎不亞于注射組，9 d內(nèi)這兩組蟹全部死亡.可以推斷該病毒以水平傳播方式為主，而且極容易相互傳染，所以本研究認為這種呼腸病毒極可能是引起最近養(yǎng)殖青蟹短期內(nèi)大規(guī)模死亡的首要原因.

3.1 血細胞變化

甲殼動物免疫防御系統(tǒng)由基本防御屏障 (甲殼和表皮)、細胞防御屏障和生理防御屏障3部分組成［14－15］.不同類型的血細胞在甲殼動物免疫系統(tǒng)中所起作用不同，其中吞噬作用是最重要的細胞免疫反應，吞噬的過程包括:異物的識別、黏連、聚集、攝入和清除等.各種血細胞在異物吞噬過程中協(xié)同發(fā)揮作用:透明細胞具有較強的吞噬能力，這種能力可以被酚氧化酶原系統(tǒng)組分激活;小顆粒細胞在脫顆粒后才具有吞噬活性;大顆粒細胞無吞噬能力，但顆粒內(nèi)含大量酚氧化酶原，經(jīng)胞吐釋放大量活性酚氧化酶，進而促進透明細胞的吞噬作用［16］.

研究表明，血細胞的數(shù)量和組成總是伴隨甲殼動物自身的生理狀況及周圍水體環(huán)境因子如溫度、鹽度、pH值等的改變而不斷發(fā)生變化，常被用作甲殼動物健康狀況的評定指標［17］.于建平用鐮刀菌(Fusarium solani)感染日本囊對蝦，14 d后發(fā)現(xiàn)血細胞密度減少為對照組的54.3%，血細胞比例也發(fā)生變化，其中小顆粒細胞比例下降11.9%，而大顆粒細胞比例升高10.6%［18］;Hauton等用曼利斯頓菌(Listonella anguillarum)感染三葉真蟹，7 d后發(fā)現(xiàn)血細胞密度從46.41×106cells/mL下降至20.76×106cells/mL［19］.血細胞吞噬外來異物，或者聚集在某些創(chuàng)傷處用于清除病灶，導致自身死亡，因此數(shù)量會減少;而且很多病原生物會破壞宿主造血組織，阻礙新的血細胞生成.但是，血細胞數(shù)量不會持續(xù)下降，Pascual等研究發(fā)現(xiàn)，機體為維持正常的生理功能，必須通過啟動一系列生理生化反應，然后將部分組織細胞遷移至循環(huán)系統(tǒng)中以補充損失的血細胞，來應對外界的脅迫，因此血細胞數(shù)量變化會出現(xiàn)波動的現(xiàn)象.將白濱對蝦(Litopenaeus setiferus)環(huán)境溫度從24℃持續(xù)升高到33℃，其血細胞數(shù)量逐漸升高，至第3 d開始下降，第6 d降至最低，隨后又慢慢回升，表現(xiàn)一種周期性波動，即血細胞每隔48～94 h遷移一次［20］.本研究發(fā)現(xiàn)，青蟹受到病毒感染后，血細胞數(shù)量在36 h開始顯著上升，至72 h達到高峰，隨后又迅速下降，呈現(xiàn)出劇烈波動的現(xiàn)象，這說明呼腸孤病毒侵染可能發(fā)生在第36～72 h，病毒侵入青蟹體內(nèi)并增殖，刺激機體產(chǎn)生大量血細胞來清除干擾，但是隨著病毒大量復制，引起血細胞大量死亡或者造血功能的障礙，血細胞數(shù)量又迅速減少.

3.2 酚氧化酶變化

甲殼動物的酚氧化酶原 (proPO)系統(tǒng)是一種類似于脊椎動物補體系統(tǒng)的酶級聯(lián)，也是體液免疫因子中最重要的部分.一般認為，正常生理條件下酚氧化酶原以非活化狀態(tài)存在于血細胞顆粒中，可以被β －1，3－葡聚糖(β －1，3－glucan，βG)、脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖 (peptidoglycan，PG)、胰蛋白、十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)、加熱或Ca2+濃度下降等條件所誘導并活化.當與異物反應時，酚氧化酶原被釋放到血淋巴中，在絲氨酸蛋白酶的作用下產(chǎn)生活性的酚氧化酶［21］，酚氧化酶可以將酚催化成黑色素，酚氧化酶、黑色素及其中間產(chǎn)物通過多種方式參與宿主防御反應，包括提供調(diào)理素，促進血細胞吞噬作用，以及介導凝集和凝固，產(chǎn)生殺菌物質(zhì)，參與細胞間信息傳遞等，因此，酚氧化酶活性大小在一定程度上可以反映蝦蟹對病害入侵的應答情況.

據(jù)實驗結(jié)果來看，對照組和第Ⅲ組各時間段PO活性沒有顯著差異，受感染的第Ⅱ組和第Ⅳ組PO活性大致呈現(xiàn)下降的趨勢，最終顯著低于對照組，證實其變化規(guī)律與病害侵入有一定關(guān)系，但是受到實驗條件限制，所測血清樣品取自不同的青蟹，然后取平均值進行統(tǒng)計分析，由于青蟹自身個體生理狀況差異較大，所以尚不能確定PO活性與時間的對應關(guān)系.實驗中所測PO活性最高值出現(xiàn)在第Ⅳ組12 h，為6.90 U，與其他組差異極顯著(P＜0.01)，而且此后下降趨勢較為明顯，在取樣時發(fā)現(xiàn)該組青蟹血淋巴微紅，不易凝固，可能是青蟹浸泡在病蟹組織粗提液中長時間處于強應急狀態(tài)，血細胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，導致酚氧化酶原的釋放和激活，PO活性明顯升高，此后血淋巴顏色逐漸恢復為淡藍色，但PO活性始終處于最低水平.

Hauton等研究發(fā)現(xiàn)三葉真蟹PO活性與潮汐變化、水溫、鹽度、水體總懸浮顆粒、有機物含量和細菌種群數(shù)變化相關(guān)，其中細菌數(shù)量的高峰值明顯對應PO活性的高峰值［19］.還有許多研究表明適量病原體抗原的存在能激活實驗蝦蟹的免疫反應，有利于提高機體的抗菌力和應急力，Sung等將實驗時暫養(yǎng)的斑節(jié)對蝦浸泡與熱致死的弧菌懸浮液中，與對照組相比，PO活性增加了13倍，李天道等以不同濃度的弧菌懸液注射感染對蝦，發(fā)現(xiàn)小劑量的弧菌可以誘導血清中PO活性增高而且能保持一段時間，劑量超過臨界值才會造成負面影響［22］.在本實驗中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，僅有浸泡組PO活性在短時間內(nèi)顯著升高，這可能不是由于病毒侵入而引起，而是被水體中懸浮顆粒量的增加而誘導，實際上青蟹受到病毒感染后PO活性呈逐漸下降的趨勢.呼腸孤病毒致病機理可能與水體中許多條件致病菌不同，當水體中細菌數(shù)量超過某個臨界值才會引起宿主患病，但是青蟹一經(jīng)呼腸孤病毒感染，無論劑量大小，短時間內(nèi)即會引發(fā)不可恢復的病理變化，而不存在某種臨界狀態(tài)，這與雷質(zhì)文等人研究WSSV對中國明對蝦PO活性影響的結(jié)果類似［23］.

3.3 超氧化物歧化酶SOD變化

抗氧化系統(tǒng)由一些能夠被氧化應激誘導的酶組成，包括超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GPX)等，其中SOD可以催化超氧陰離子生成H2O2.研究表明，SOD活性與生物的免疫水平密切相關(guān)，可作為機體非特異性免疫指標，甚至定量指標，其活性的變化反映了機體抵制自由基損傷的能力［24］.

免疫細胞在吞噬病原微生物后，依賴活性氧的殺傷機制，即所謂的呼吸爆發(fā).甲殼動物的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象是近十幾年來才被發(fā)現(xiàn)的，Bell和Smith研究發(fā)現(xiàn)三葉真蟹血細胞可產(chǎn)生超氧陰離子［25］，Mu?oz等也證實了凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)體內(nèi)超氧陰離子的存在［26］.大量研究表明，實驗動物患病后SOD活性呈顯著下降趨勢，主要是機體在病原體的誘導下產(chǎn)生過多活性氧的緣故.王江勇等發(fā)現(xiàn)雜色鮑(Haliotis diversicolor)血清中SOD活性在注射病毒懸液后8 h開始變化，從初始水平(222.96 U)升至最高 (321.08 U)，然后逐漸降低，至48 h降至最低，并低于初始水平［27］.而作者發(fā)現(xiàn)，各實驗組青蟹血清SOD活性呈無規(guī)律的變化，即使是對照組也出現(xiàn)不斷的波動，受感染的兩組其SOD活性大致上低于對照組，但不明顯，有時也出現(xiàn)高于對照組的情況，因此SOD活性變化不能很好地表征青蟹受病毒感染的狀況.可能有以下幾方面原因:1)雌雄差異較大，比如克氏原螯蝦(Procambius clarkii)和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)雄性個體SOD活性略高于雌性個體［28］，而本文在實驗中沒有分開測定，造成規(guī)律不明顯;2)個體差異較大，以致掩蓋SOD實際變化規(guī)律;3)SOD受環(huán)境脅迫影響較大，出現(xiàn)不斷波動的現(xiàn)象.

3.4 堿性磷酸酶AKP變化

堿性磷酸酶 (AKP)與細胞膜的物質(zhì)運輸有關(guān)，直接參與機體的磷代謝，對甲殼動物鈣質(zhì)的吸收、磷酸鈣的沉積、甲殼素的分泌和形成都具有重要作用，從而影響甲殼動物基本免疫防御屏障的形成.在病理狀態(tài)下，血清中升高的AKP活性與小顆粒細胞的解體及其顆粒的排放有關(guān)［29］.據(jù)實驗結(jié)果來看，對照組和第Ⅲ組的AKP活性有少許波動，基本平穩(wěn)，第Ⅱ組和第Ⅳ組的AKP活性明顯比對照組低，第Ⅱ組在36 h達到峰值，而后持續(xù)下降，第Ⅳ組一直保持在較低水平，這與雷質(zhì)文等［23］研究的結(jié)果一致.

［1］ SAHUL HAMEED A S，YOGANANDHAN K，SATHISH S，et al.White spot syndrome virus(WSSV)in two species of freshwater crabs(Paratelphusa hydrodomous and P．pulvinata)［J］.Aquaculture，2001，201:179－186.

［2］ MARI J，BONAMI J R.A parvo－like virus from the crab Carcinus mediterraneus:pathological aspects，ultrastructure of the agent，and first biochemical characterization ［J］.J Invertebr Pathol，1988，51:145－156.

［3］貢成良，薛仁宇，曹廣力，等.中華絨螯蟹呼腸孤病毒樣病毒病研究 ［J］.中國病毒學，2000，15(4):395－399.

［4］張叔勇，鄭大勝，白志強，等.一株鋸緣青蟹呼腸孤病毒的分離純化及鑒定 ［J］.海洋漁業(yè)，2007，29(3):277－280.

［5］ WENG S P，GUO Z X，SUN J J，et al.A reovirus disease in cultured mud crab，Scylla serrata，in southern China［J］.Journal of Fish Diseases，2007，30:133－139.

［6］鄒清，秦驥，朱小明.鋸緣青蟹一種球狀病毒的分離和組織病理觀察［J］.廈門大學學報:自然科學版，2007，46(6):884－888.

［7］ VAGO C.A virus disease in crustacea(Portunus depurator L．)［J］.Nature，1966，209:1290.

［8］ JOHNSON P T.A viral disease of the blue crab，Callinectes sapidus:histopathology and differential diagnosis ［J］.J Invertebr Pathol，1977，29:201－209.

［9］ MARI J，BONAMI J R.A reolike virus of the Mediterranean shore crab Carcinus mediterraneus［J］.Dis aquat Org，1987，3:107－112.

［10］ MARI J，BONAMI J R.W2 virus infection of the Crustacean Carcinus mediterraneus:a reovirus disease ［J］.J Gen Virol，1988，69:561－571.

［11］張叔勇，張建紅，黃燦華，等.中華絨螯蟹二株呼腸孤病毒的初步研究［J］.中國病毒學，2002，17(3):263－265.

［12］ ZHANG S，SHI Z，ZHANG J.Purification and characterization of a new reovirus from the Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis ［J］.Journal of Fish Diseases，2004，27:687－692.

［13］孫學強，陸承平.河蟹顫抖病病毒的分離純化及其動物致病性試驗 ［J］.中國病毒學，2002，17(2):185－188.

［14］ SMITH V J，CHISHOLM R S.Non－cellular immunity in crustaceans ［J］.Fish ＆ Shellfish Immunol，1992，2:1－31.

［15］ BACHèRE E.Shrimp immunity and disease control［J］.Aquaculture，2000，191:3－11.

［16］ MUTA T，IWANAGA S.The role of hemolymph coagulation in innate immunity ［J］.Curr Opin Immunol，1996，8(1):7－41.

［17］ LEMOULLAC G，SOYEZ C，SAULNIER，et al.Effect of hypoxic stress on the immune response and the resistance to vibriosis of the shrimp Penaeus stylirostris［J］.Fish ＆ Shellfish Immunol，1998，8:621－629.

［18］于建平.日本對蝦血細胞分類、密度及組成 ［J］.青島海洋大學學報，1993，23(1):107－114.

［19］ HAUTON C，HAWKINS L E，WILLIAMS J A.In situ variability in phenoloxidase activity in the shore crab，Carcinus maenas(L)［J］.Comp Biochem Physiol，1997，117b:267－271.

［20］ PASCUAL C，SáNCHEZ A，VARGAS－ALBORES F，et al.Haemolymph metabolic variables immune response in Litopenaeus setiferus adult males:the effect of an extreme temperature ［J］.Aquaculture，2003，218:637－650.

［21］ ASPáN A，S?DERH?LL K.Purification of prophenolocidase from crayfish blood cells and its activation by an endogenous serine proteinase ［J］.Insect Biochem，1991，21:363－373.

［22］李天道，于佳，俞開康.中國對蝦血清中酚氧化酶活力研究 ［J］.海洋湖沼通報，1998(1):51－56.

［23］雷質(zhì)文，黃倢，楊冰，等.感染白斑綜合癥病毒 (WSSV)對蝦相關(guān)免疫因子的研究［J］.中國水產(chǎn)科學，2001，8(4):46－51.

［24］孫虎山，李光友.櫛孔扇貝血淋巴中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性及其性質(zhì)的研究 ［J］.海洋與湖沼，2000，31(3):259－265.

［25］ BELL K L，SMITH V J.In vitro superoxide production by hyaline cells of the shore crab Carcinus maenas(L) ［J］.Dev Comp Immunol，1993，17:211－219.

［26］ MU?OZ M，CEDEO R，RODGUEZ J，et al.Measurement of reactive oxygen intermediate production in haemocytes of the penaeid shrimp，Penaeus vannamei［J］.Aquaculture，2000，191:89－107.

［27］王江勇，郭志勛，馮娟，等.病毒感染后雜色鮑部分血清免疫因子的變化 ［J］.中國水產(chǎn)科學，2005，12(3):344－347.

［28］曹廣力，朱越雄，許宏慶，等.四種甲殼動物超氧化物歧化酶活性檢測初報 ［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，1999(1):15－16.

［29］丁美麗，林林，李光友，等.有機污染對中國對蝦體內(nèi)外環(huán)境影響的研究 ［J］.海洋與湖沼，1997，28(1):7－11.

(責任編輯 朱雪蓮 英文審校 馬 英)

Effects of Artifical Infection Reovirus Trails on Some Immune Factors of Mud Crab，Scylla paramamosain

ZOU Qing1，2，LI Jun－h(huán)ua1，3，ZHU Xiao－ming1
(1.College of the Environment and Ecology，Xiamen University，Xiamen 361005，China;2.Wenzhou Marine Environmental Monitoring Center of State Ocean Administration，Wenzhou 325000，China;3.Shandong Oriental Ocean Sci－Tech Co.，Ltd.，Yantai 264003，China)

The influence of artifical infection reovirous trails on the hemocyte density and the phenoloxidase(PO)，superoxide dismutase(SOD)and alkaline phosphatase activity(AKP)of the serum from Mud Crab，Scylla paramamosain was examined.The results showed that the healthy crab would be infected by virous injection and bath exposure in the virus extraction，There were no obvious difference between two treatments in mortality and latency period of the experimental animals，all crabs died in 7～9 d after infection.Changes of some interrelated immune factors such as activities of PO，SOD and AKP displayed the downtrend day by day，while the hemocyte density rose evidently after 36 h and reached the peak value(2.8534×107cells/mL)at 72 h，It recovered to the same level as the control group after 108 h.In conclusion，the changes of hemocyte density and PO，AKP activity except SOD activity would be used to assist diagnoses of crabdiseases.

Scylla paramamosain;reovirus;immune factors

S 945.6

A

1007－7405(2012)05－0327－08

2012－05－15

2012－09－05

福建省自然科學基金資助項目 (2009J01224)

鄒清 (1981—)，男，碩士，從事海洋生態(tài)及監(jiān)測研究.通訊作者:朱小明 (1966—)，男，教授，從事增養(yǎng)殖生態(tài)工程及管理研究.E－mail:zxm@xmu.edu.cn.