鹽酸巴馬汀抑制聚甲基丙烯酸甲酯顆粒誘導(dǎo)骨溶解的實(shí)驗(yàn)研究

張少坤，梁慶威，王赫，佐井光一，阮原芳

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

人工關(guān)節(jié)無菌性松動是影響人工關(guān)節(jié)使用壽命和遠(yuǎn)期療效最重要的并發(fā)癥［1，2］，磨損顆粒誘發(fā)假體周圍組織細(xì)胞產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)是導(dǎo)致假體周圍骨溶解及假體無菌性松動的重要因素。磨損顆粒刺激假體周圍的巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，形成破骨細(xì)胞性骨吸收，同時(shí)影響成骨細(xì)胞的分化及功能，抑制骨形成。藥物在預(yù)防和治療磨損顆粒引起的人工關(guān)節(jié)松動方面能起到積極的作用。鹽酸巴馬汀是從防己科植物黃藤的干燥藤莖中提取精制而得，其具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤和較強(qiáng)的抗菌作用，最新研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸巴馬汀對破骨細(xì)胞及其信號傳導(dǎo)通路有抑制作用［3］。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠顱骨模型模擬人工關(guān)節(jié)無菌性松動的生物學(xué)環(huán)境，觀察鹽酸巴馬汀在體內(nèi)抑制炎性反應(yīng)、減輕溶骨反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和材料

1月齡昆明雄性小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，購于中國醫(yī)科大學(xué)動物科學(xué)部。聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）顆粒取自人工關(guān)節(jié)置換術(shù)中所用骨水泥（德國Link公司），由東北大學(xué)材料與冶金學(xué)院加工，平均粒徑16.3 μm，90%顆粒的粒徑小于31 μm。PMMA顆粒用70%乙醇沖洗3次后環(huán)氧乙烷消毒，經(jīng)檢測不含內(nèi)毒素。將顆粒在PBS中稀釋，濃度為10 mg/mL。鹽酸巴馬?。óa(chǎn)品號361615，分子量387.86）購自美國 Sigma-Aldrich公司，用PBS稀釋濃度至1 mg/mL?？咕剖崴嵝粤姿崦福╰artrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（產(chǎn)品號387A-1KT），購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

40只小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，稱質(zhì)量并標(biāo)記，A組為空白組，B組為陽性對照組，C組為實(shí)驗(yàn)組，D組為陰性對照組。參照von Knoch等［4］的方法構(gòu)建小鼠顱骨模型。用10%水合氯醛（3 mL/100 g）麻醉，麻醉成功后小鼠頭部用碘附消毒，鋪無菌巾，取小鼠顱頂矢狀線切開皮膚及皮下組織，暴露1 cm2范圍完整的骨膜，剝離骨膜，暴露顱骨。其中B、C組小鼠用微量注射器在骨膜下注入經(jīng)超聲分散器分散后的PMMA顆粒懸液0.3 mL，顆粒均勻分布于顱骨表面，A、D組在顱骨表面注入生理鹽水0.3 mL，然后縫合傷口。小鼠麻醉蘇醒后分籠飼養(yǎng)。術(shù)后第2日起，A、B組小鼠顱骨植入顆粒處每日局部注射PBS 0.1 mL，C、D組每日注射鹽酸巴馬汀溶液0.1 mL。2周后以過量麻醉方式處死實(shí)驗(yàn)小鼠。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 一般情況觀察：觀察各組小鼠存活以及術(shù)后切口愈合等情況。

1.3.2 大體觀察：術(shù)后14 d處死全部小鼠，無菌條件下取出顱骨，大體觀察顱骨片表面骨溶解和骨膜炎性反應(yīng)情況。

1.3.3 骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）和骨礦物含量（bone mineral content，BMC）檢測：小鼠處死后剝離小鼠顱骨，應(yīng)用XR-36型雙能X線骨密度儀，分辨率為1.0 mm×1.0 mm，速度為40 mm/s，測定離體顱骨的BMC和BMD。

1.3.4 骨溶解分析：將標(biāo)本置于4%甲醛溶液中固定12 h，EDTA脫鈣液中脫鈣14 d，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋后制備厚5 μm連續(xù)切片。取部分切片行HE染色，使用多功能顯微鏡（BX-51，日本OLYMPAS公司）觀察顱骨片表面侵蝕及骨膜炎性反應(yīng)情況。每個(gè)標(biāo)本取5張不連續(xù)切片，利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測炎性細(xì)胞個(gè)數(shù)。每張切片計(jì)數(shù)藍(lán)色深染細(xì)胞核數(shù)目即為炎性細(xì)胞總數(shù)，取平均值。

1.3.5 破骨細(xì)胞分析：取部分切片按照TRAP染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，使用多功能顯微鏡觀察骨溶解區(qū)域內(nèi)破骨細(xì)胞。顱骨骨溶解區(qū)域內(nèi)呈藍(lán)色深染的多核細(xì)胞為TRAP陽性破骨細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有動物術(shù)中、術(shù)后均無死亡，術(shù)后傷口愈合良好，無紅腫、流膿。

2.2 大體觀察

B組取出的顱骨表面由白色的炎性組織和顆粒沉積覆蓋，清除表面炎性組織及顆粒后，可見骨表面凹凸不平，骨質(zhì)溶解明顯。C組顱骨表面可見少許白色炎性組織，清除炎性組織后顱骨表面未見明顯改變。A、D組取出的顱骨表面無炎性組織，顱骨表面光滑，骨質(zhì)完好。

2.3BMD及BMC檢測

B組BMD、BMC與A組比較均降低（P<0.05）；注射PMMA顆粒的C組小鼠，在注射藥物后BMD和BMC與B組比較顯著升高（P<0.05），但低于A組（P<0.05）；D 組 BMD、BMC 高于 B、C 組（P<0.05），但和A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.4 骨溶解分析

B組炎性細(xì)胞浸潤明顯，計(jì)數(shù)較其余3組明顯增多（P<0.05），組織切片可見較多的骨吸收區(qū)域，骨性結(jié)構(gòu)破壞較多；C組炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)較B組明顯減少（P<0.05），但較 A、D 組多（P<0.05）；A、D 組炎性細(xì)胞浸潤不明顯，顱骨表面未見骨吸收區(qū)域，骨質(zhì)均勻致密，2組比較炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表 1、圖 2。

表1 各組BM D、BM C及組織學(xué)檢測結(jié)果Tab.1 The resul t s ofBM D，BM C and hi st ol ogi calobservat i on i n 4 groups Group n BMD（g/cm2） BMC（kg） No.of inflammatory cells No.of osteoclasts A 10 0.132±0.004 0.425±0.023 1 496±6512），3） 02），3）B 10 0.109±0.0051） 0.353±0.0291） 4 031±1 186 8.85±2.54 C 10 0.120±0.0061），2） 0.418±0.0331），2） 1 965±1 1102） 3.72±1.462）D 10 0.133±0.0052），3） 0.426±0.0252），3） 1 030±4802），3） 02），3）1）P<0.05 vs group A；2）P<0.05 vs group B；3）P<0.05 vs group C.

2.5 破骨細(xì)胞含量分析

B組TRAP陽性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)較其余3組增多（P<0.05）；C組TRAP陽性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)低于B組（P<0.05），但高于 A、D 組（P<0.05）；A、D 組可見骨質(zhì)均勻，無TRAP陽性破骨細(xì)胞。見表1、圖3。

3 討論

目前，較多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后出現(xiàn)的假體周圍無菌性松動與巨噬細(xì)胞吞噬磨損顆粒進(jìn)而激活RANKL-RANK-OPG信號傳導(dǎo)通路有著密切的聯(lián)系。RANKL-RANK-OPG軸是影響破骨細(xì)胞分化、發(fā)育及調(diào)節(jié)其功能唯一的途徑，該通路的激活使骨吸收加強(qiáng)、骨形成減少從而引起骨溶解［5］。RANKL、OPG表達(dá)于同一類型的細(xì)胞，二者的平衡是維持局部骨代謝平衡的關(guān)鍵［6］。研究發(fā)現(xiàn)，界膜內(nèi)RANKL/RANK的含量明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎滑膜內(nèi)的含量，而OPG的含量與正常及骨性關(guān)節(jié)炎滑膜內(nèi)含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且OPGmRNA僅在界膜內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中少量表達(dá)。表明在松動假體周圍組織內(nèi)，RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)的表達(dá)呈失衡狀態(tài)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，無菌松動假體周圍發(fā)生骨溶解的部位一般都有大量含磨損顆粒的多核巨細(xì)胞存在，而RANKL/RANKmRNA也主要由這些巨噬細(xì)胞表達(dá)，表明RANKL/RANK增多與巨噬細(xì)胞吞噬磨損顆粒有關(guān)［8］。

目前，作用于上游細(xì)胞因子試圖阻斷炎癥信號傳導(dǎo)的相關(guān)研究很多，體外實(shí)驗(yàn)效果肯定。但在體內(nèi)環(huán)境中，由于各種上游細(xì)胞因子間復(fù)雜的級聯(lián)交互作用，干預(yù)因素的作用不明顯。RANKL-RANKOPG信號通路位于炎癥信號傳導(dǎo)通路的下游，并且是激活破骨細(xì)胞的主要途徑［9］。至今已有多項(xiàng)研究表明RANKL抗體可阻斷RANKL-RANK-OPG信號通路，有效抑制破骨細(xì)胞的激活，減輕骨溶解［10］，從而治療骨質(zhì)疏松癥［11］。本實(shí)驗(yàn)研究了RANKL抗體鹽酸巴馬汀能否在體內(nèi)有效阻斷磨損顆粒所致炎性反應(yīng)的傳導(dǎo)通路，抑制溶骨反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)選用小鼠顱骨模型，觀察鹽酸巴馬汀抑制骨溶解作用。顱骨模型是一種經(jīng)典的骨溶解模型［4］，小鼠顱骨表面積大，而且完全排除了機(jī)械力學(xué)因素方面的影響，從而可以最真實(shí)地模擬生物學(xué)因素對人工關(guān)節(jié)無菌性松動的影響。目前認(rèn)為超高分子量聚乙烯顆粒在引起假體周圍骨溶解的過程中起主要作用，同時(shí)金屬顆粒和骨水泥顆粒也可以引起骨溶解，且三者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［12］。本實(shí)驗(yàn)采用人工關(guān)節(jié)置換術(shù)中所用的骨水泥，通過人工加工制成接近于無菌性松動假體周圍的磨損顆粒，在植入小鼠顱骨表面后成功模擬出骨溶解模型。結(jié)果顯示，B組與其他3組比較破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨溶解程度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，再次證明PMMA顆?？梢砸鹦∈箫B骨模型中破骨細(xì)胞的分化成熟。術(shù)后14 d取出標(biāo)本，可以明顯看到注射PMMA顆粒的B組和其他各組相比，小鼠顱骨表面炎性反應(yīng)、骨溶解效應(yīng)及破骨細(xì)胞數(shù)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而注射鹽酸巴馬汀的C組小鼠顱骨表面炎性反應(yīng)、骨溶解效應(yīng)及BMD與B組相比得到好轉(zhuǎn)，但是不如A、D組。這說明鹽酸巴馬汀可以在一定程度上抑制RANKLRANK-OPG信號傳導(dǎo)通路，從而抑制破骨細(xì)胞活性。A、D組各項(xiàng)數(shù)據(jù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示在不施加PMMA顆粒的情況下，鹽酸巴馬汀對骨組織沒有明顯的作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鹽酸巴馬汀通過抑制成骨細(xì)胞中RANKL基因的表達(dá)來減弱破骨細(xì)胞的分化，發(fā)揮對破骨細(xì)胞的抑制作用，僅有成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞存在的情況下，鹽酸巴馬汀不能很好的發(fā)揮其阻斷RANKL/RANK信號傳導(dǎo)通路的作用［3］。正常骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量較少，散在分布在骨組織邊緣。D組小鼠顱骨表面未注射PMMA顆粒，未能激活RANKL-RANK-OPG信號通路和破骨細(xì)胞，這就導(dǎo)致了鹽酸巴馬汀不能很好的發(fā)揮其對破骨細(xì)胞的抑制作用。所以從HE染色、TRAP染色、BMD和BMC測量結(jié)果來看，A、D組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過用RANKL抑制劑鹽酸巴馬汀抑制PMMA顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨模型中破骨細(xì)胞的分化成熟，證實(shí)RANKL-RANK-OPG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了假體無菌性松動的過程。同時(shí)，我們也認(rèn)為鹽酸巴馬汀對防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動有一定的作用，為防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動提供了新的思路和理論基礎(chǔ)，可能成為防治人工關(guān)節(jié)假體松動的方法。但是鹽酸巴馬汀如何作用于RANKL、對破骨細(xì)胞形態(tài)是否有影響、其療效和藥物劑量之間是否有關(guān)系等一系列問題還有待進(jìn)一步研究。

［1］Hallab NJ，Jacobs JJ.Biologic effects of implant debris［J］.Bull NYU Hospital Jt Dis，2009，67（2）：182-188.

［2］Naudie DD，Ammeen DJ，Engh GA，et al.Wear and osteolysis around total knee arthroplasty ［J］.J Am Acad Orthop Surg，2007，15（1）：53-64.

［3］Lee JW，Mase N，Yonezawa T，et al.Palmatine attenuates osteoclast differentiation and function through inhibition of receptor activator of nuclear factor-κB ligand expression in osteoblast cells ［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（10）：1733-1739.

［4］von Knocha M，Wedemeyer C.The decrease of particle-induced osteolysis after a single dose of bisphosphonate［J］.Biomaterials，2005，26（14）：1803-1808.

［5］吳學(xué)賓，陳建新，周越，等.免疫抑制劑環(huán)胞素A對鼠骨代謝的生物學(xué)效應(yīng)［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（2）：133-136.

［6］周雄文，劉迎春，翦新春，等.核因子κB受體活化因子配體、護(hù)骨素在不同月齡雄性大鼠股骨的表達(dá)［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（9）：1539-1542.

［7］Crotti TN，Smith MD，F(xiàn)indlay DM，et al.Factors regulating osteoclast formation in human tissues adjacent to peri-implant bone loss：expression of receptor activator NFkappaB，RANK ligand and osteoprotegerin［J］.Biomaterials，2004，25（4）：565-573.

［8］Roux S，Mariette X.The high rate of bone resorption in multiple myeloma is due to RANK （receptor activator of nuclear factor-κB）and RANKL expression［J］.Leuk Lymphoma，2004，45（6）：1111-1118.

［9］McClung MR，Lewiecki EM，Cohen SB，et al.Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density［J］.N Engl J Med，2006，354（8）：821-831.

［10］Cohen SB，Dore RK，Lane NE，et al.Denosumab treatment effects on structural damage，bone mineral density，and bone turnover in rheumatoid arthritis：a twelve-month，multicenter，randomized，double-blind，placebo-controlled，phase Ⅱ clinical trial. ［J］.Arthritis Rheum，2008，58（5）：1299-1309.

［11］Brown JP，Prince RL，Deal C，et al.Comparison of the effect of denosumab and alendronate on BMD and biochemical markers of bone turnover in postmenopausal women with low bone mass：a randomized，blinded，phase 3 trial ［J］.J Bone Miner Res，2009，24（1）：153-161.

［12］趙建寧，林秾，王與榮，等.不同微粒對人工關(guān)節(jié)假體周圍界膜影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2002，17（1）：33-36.