綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯對酸蝕癥牙本質(zhì)膠原降解作用的初步研究

陳黃琴 黃彬

（湖北科技學(xué)院 口腔教研室，咸寧 437100）

牙齒酸蝕癥是指在沒有細(xì)菌參與的情況下，由于酸的化學(xué)侵蝕或螯合作用，牙體表面硬組織局部性、病理性、慢性進(jìn)行性喪失的一種疾病[1]。釉質(zhì)酸蝕表現(xiàn)為一種向心性的礦物質(zhì)溶解過程，直至暴露釉質(zhì)下方的牙本質(zhì)。脫礦牙本質(zhì)中，有機質(zhì)的存在能阻擋離子的擴散，減少酸蝕底物的喪失[2]，并能保護(hù)剩余的脫礦牙本質(zhì)抵擋刷牙等機械性磨損[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶，是酸蝕癥過程中降解牙本質(zhì)有機質(zhì)的主要蛋白水解酶之一。鑒于保存脫礦的牙本質(zhì)有機質(zhì)有利于減緩酸蝕癥的發(fā)展，尋找、使用MMPs抑制劑，通過降低有機質(zhì)的降解間接影響酸蝕進(jìn)程就顯得十分重要。綠茶多酚，特別是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是MMPs的天然抑制劑，對多種腫瘤細(xì)胞系的MMP-2和MMP-9有明顯的抑制作用[4]。本試驗采用雙盲隨機對照的方法，在自然口腔生態(tài)環(huán)境下，研究天然藥物EGCG對牙本質(zhì)抗酸蝕作用的影響。為開發(fā)天然藥物防治酸蝕癥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及配制方法

EGCG（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，Sigma公司，美國）。Ⅰ型膠原羧基端肽（carboxy-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，ICTP）的檢測設(shè)備γ放射免疫計數(shù)儀（FJ-2008PS型，西安核儀器廠）由咸寧市中心醫(yī)院放射免疫科提供。

EGCG凝膠的制備：先將EGCG溶于去離子水中，一次性抽濾器抽濾消毒，備用。將羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）在持續(xù)攪拌的狀態(tài)下緩慢均勻地分散到去離子水中，待其完全溶解，濾去雜質(zhì)后，高溫高壓消毒備用。再將消毒過的CMC水凝膠放置在振蕩器上，邊振蕩邊逐滴滴加EGCG溶液，直至兩者充分混合，EGCG和CMC的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%和2%。安慰劑凝膠（CMC凝膠）制法同上，只是不添加EGCG溶液。共制備凝膠制品64份，每種各32份。每個凝膠制品包裝一致，只是編號不同。只有負(fù)責(zé)編號的老師知道不同編號對應(yīng)的凝膠種類，此人不再參與本試驗的其他內(nèi)容。

1.2 研究對象

研究對象為湖北科技學(xué)院在校大學(xué)生，年齡18～22歲。研究者利用新生體檢數(shù)據(jù)，根據(jù)Eccles和Jenkins[5]提出的牙齒酸蝕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)和O’Sullivan[6]提出的牙齒酸蝕癥評分指數(shù)，選取酸蝕癥志愿者64名為研究對象，其中男生35名，女生29名。64名志愿者的酸蝕癥損害為釉質(zhì)缺失、牙本質(zhì)暴露（釉牙本質(zhì)界可見），或者釉質(zhì)和牙本質(zhì)缺失達(dá)牙本質(zhì)深層，即酸蝕指數(shù)為3～4分。所有志愿者均無活動性齲、無牙齦出血、無系統(tǒng)性疾病，近2周無服藥史。試驗前征得所有學(xué)生的同意，并簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 個別托盤的制作及使用 將成品熱固化成形牙套放入沸騰的熱水中約5 s，使其軟化，將水甩干后將軟的牙套放入志愿者口中，用手指緊壓牙齒的舌面、唇側(cè)和咬合面，同時用舌頭頂住內(nèi)面擠出里面的空氣和水，15 s后取出放進(jìn)冷水中使牙套凝固。用小剪刀剪去牙齦以下的部分即制作完成。使用時，在托盤3┼3的區(qū)域注入1 mL凝膠，放入口中輕輕咬合，使得凝膠均勻分布在各個牙面。要求志愿者在睡時使用，第2天清晨起床后取下（每天戴用約8 h）。

1.3.2 培養(yǎng)液的收集及檢測 取出托盤后，立即在托盤內(nèi)注入0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液1 mL，放在搖床上輕輕搖晃10 min，收集上下頜托盤內(nèi)的PBS溶液裝入試管中，置于漩渦振蕩器上振蕩1 min使其充分混合。從混合溶液中吸取100 μL，使用芬蘭Orion Diagnostica公司提供的ICTP放射免疫試劑盒測定ICTP的質(zhì)量濃度。

1.4 試驗設(shè)計

試驗開始前2周，給每位志愿者發(fā)放無氟牙膏，要求志愿者每天早晚2次用其刷牙，同時隨機分發(fā)帶有不同編號的凝膠制品。試驗組和對照組各32名，分別使用EGCG凝膠和CMC凝膠。試驗開始前1 d，收集培養(yǎng)液進(jìn)行ICTP基線測量，這時托盤中注入的是CMC凝膠，以后每日使用隨機分發(fā)的帶有編號的凝膠，持續(xù)4周。于試驗的第1、2、3、4周清晨收集培養(yǎng)液，進(jìn)行ICTP質(zhì)量濃度的測定，方法見1.3.2。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件13.0處理數(shù)據(jù)，各組均數(shù)的比較用單因素方差分析和Newman-Keul法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

試驗組和對照組在不同的觀察時間點測定的ICTP質(zhì)量濃度見表1。由表1可見：凝膠的種類和使用時間對ICTP的質(zhì)量濃度均有影響。對照組（CMC凝膠組）ICTP的質(zhì)量濃度隨著時間的增長呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.05），到第3周趨于平穩(wěn)，3、4周ICTP質(zhì)量濃度的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。試驗組（EGCG凝膠組）ICTP的質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)出隨時間增長而下降的趨勢（P＜0.05），到第3周時也基本趨于穩(wěn)定，3、4周的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對于同一時間點試驗組和對照組ICTP質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，除了2組的基線測量值沒有差異（P＞0.05）之外，其余各時間點的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對照組均高于試驗組。

表 1 不同時間點對照組和試驗組的ICTP測量結(jié)果Tab 1 ICTP values at different time points in the control and experimental groups μg·L-1

3 討論

近年來，流行病學(xué)調(diào)查[7]表明：酸蝕癥在人群中普遍存在，且發(fā)病率呈上升趨勢。有學(xué)者[8]調(diào)查了我國1 949名3～5歲學(xué)齡前兒童的上頜切牙，發(fā)現(xiàn)有112名（占5.75%）患有牙酸蝕癥。酸蝕癥可引起牙齒的釉質(zhì)損害，嚴(yán)重者可侵犯牙本質(zhì)和牙髓，導(dǎo)致牙齒過敏，甚至牙髓暴露及牙齒折斷。目前，臨床上常用的治療酸蝕癥的藥物主要是氟化物及其衍生物，然而隨著局部應(yīng)用氟化物濃度、頻率的增加以及多種氟化物制劑的廣泛使用，易導(dǎo)致耐氟菌株的選擇性生長，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制[9]。因此，研究開發(fā)能有效阻止因酸蝕造成的牙體硬組織慢性損傷的藥物顯得十分重要。酸蝕癥是一個多因素的疾病，與頻繁消費酸性飲料及食物、患某些疾病使胃酸頻繁進(jìn)入口腔內(nèi)接觸牙齒等有一定的關(guān)系。本試驗選取的研究對象是在校大學(xué)生，一般無頻繁嘔吐、反胃等現(xiàn)象，造成酸蝕癥的原因主要是頻繁消費酸性飲料，因而降解牙本質(zhì)有機質(zhì)的蛋白水解酶主要是MMPs而不是胃蛋白酶和胰蛋白酶。已有研究[4]證實：EGCG能顯著抑制MMP-2和MMP-9的活性。另有學(xué)者[3]發(fā)現(xiàn)：與水相比，用綠茶漱口能減少酸蝕或磨耗情況下牙本質(zhì)的磨損。因此，選用EGCG作為研究藥物理論上是可行的。

本試驗選擇ICTP作為衡量膠原降解程度的指標(biāo)。ICTP是由MMPs介導(dǎo)的成熟的Ⅰ型膠原（牙本質(zhì)有機質(zhì)的主要成分）降解過程中產(chǎn)生的特異性物質(zhì)。檢測ICTP水平是定量分析MMPs降解Ⅰ型膠原酶活性最可靠的方法之一。在已知的與硬組織吸收有關(guān)的膠原降解蛋白酶中，只有MMPs能夠產(chǎn)生ICTP，其釋放只能被MMPs抑制劑特異性抑制，而不能被半胱氨酸蛋白酶抑制劑所抑制，因此檢測ICTP的敏感性、特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于檢測膠原其他片段如羥脯氨酸等。本試驗結(jié)果顯示，凝膠中添加EGCG使得ICTP的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降趨勢，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明EGCG能夠降低牙本質(zhì)有機質(zhì)的降解，從而具備減緩牙本質(zhì)酸蝕進(jìn)程的潛能。EGCG能減少酸蝕癥患牙培養(yǎng)液中ICTP質(zhì)量濃度的原因主要有兩個。1）EGCG含有3,4,5-三羥苯甲酰基團(tuán)，能通過氫鍵和多酚疏水作用穩(wěn)定膠原。研究[10]證實：EGCG比一般的化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛、碳化二亞胺更能穩(wěn)定膠原，保護(hù)膠原鏈不被膠原酶降解。2）EGCG能直接抑制MMP-2和MMP-9的活性。MMP-2和MMP-9是降解牙本質(zhì)膠原主要的蛋白水解酶。酸蝕發(fā)生時，牙本質(zhì)脫礦，由于唾液的緩沖作用使酸蝕環(huán)境由酸性逐漸變成中性，在此變化過程中牙本質(zhì)有機質(zhì)的膠原纖維暴露，暴露的膠原蛋白首先被MMP-8剪切成片段，然后被MMP-2和MMP-9進(jìn)一步降解[11]。因此，EGCG作為MMP-2和MMP-9的抑制劑，能有效降低牙本質(zhì)膠原的降解。對照組ICTP的含量表現(xiàn)為逐步上升的趨勢，推測其主要原因是由于唾液的流動性和緩沖能力等因素對釉質(zhì)酸蝕有一定的保護(hù)作用[12-13]。唾液中的鈣磷濃度處于過飽和狀態(tài)，能夠在釉質(zhì)酸蝕早期彌補礦物質(zhì)的喪失，而且唾液中的氟可通過形成氟磷灰石樣結(jié)構(gòu)增強表面溶解晶體的再礦化，比羥磷灰石更好地抵抗酸蝕作用[14]。對照組中雖然沒有使用EGCG，但是含有CMC凝膠的托盤大大減少了唾液與牙面的直接接觸，從而降低了唾液及唾液獲得性膜對牙齒酸蝕的保護(hù)作用，因此，對照組ICTP的含量表現(xiàn)為逐步上升的趨勢。綜上所述，EGCG能有效減少脫礦牙本質(zhì)膠原的降解，提高牙本質(zhì)抗酸蝕的能力，具有進(jìn)一步研究、開發(fā)的潛能。

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