新型多孔磷酸鈣支架對骨髓間充質(zhì)干細胞生物學行為的影響

王淑紅 張雄 張勁娥 黃遠亮，3

（1.同濟大學 口腔醫(yī)學院，上海 200072；2.杭州市第一人民醫(yī)院 口腔科，杭州 310006；3.同濟大學附屬東方醫(yī)院 口腔科，上海 200120）

與既往的組織移植、替代材料相比，組織工程技術(shù)為骨缺損提供了更理想的修復方法[1-2]，主要包括種子細胞和支架材料兩部分。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨組織工程中較公認的種子細胞，目前的研究主要集中于其成骨潛能[2-3]；支架材料的研究則主要集中在多孔磷酸鈣（calcium phosphate cement，CPC）、磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）等無機多孔材料及聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]、明膠海綿（gelatin sponge，GS）等高分子可降解材料領域[3-4]。每種材料各有優(yōu)缺點，其中無機材料因為其良好的生物相容性而得到更多認可，但存在強度不足、降解速率過慢等缺陷，而多數(shù)高分子材料在降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物引起的無菌性炎癥顯著阻礙了其廣泛應用。目前為止，尚無一種支架材料能夠滿足組織工程化骨構(gòu)建的所有要求。本實驗所用的支架材料新型CPC是上海瑞邦生物材料有限公司的專利產(chǎn)品（專利號：ZL 021508852），是將CPC經(jīng)過調(diào)整制備條件、漿體微結(jié)構(gòu)、孔徑和孔隙率等然后改性而成。本研究旨在探索新型CPC支架材料對BMSCs黏附、增殖及成骨分化的影響，為進一步的動物實驗提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），地塞米松、β-磷酸甘油鈉、維生素C、茜素紅（alizarin red-S，ARS）（Sigma公司，美國），青霉素和鏈霉素（Hyclone公司，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（Sigma公司，美國）；新型CPC（上海瑞邦生物材料有限公司），PLGA、TCP（上海貝奧路生物材料有限公司）。

1.2 實驗儀器

超凈工作臺，恒溫細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度，Thermo Forma公司，美國），一次性培養(yǎng)皿（Corning公司，美國），熒光顯微鏡（Hyclone公司，美國），倒置相差顯微鏡（inverted phase contrast microscope，IPCM）（Nikon公司，日本），紫外分光光度計（Beckman公司，美國）。

1.3 實驗動物

1～1.5歲健康Beagle犬，體重10～15 kg，雌雄不限，要求為一級實驗動物，由上海交通大學口腔醫(yī)學院動物中心提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 BMSCs的培養(yǎng)與誘導 在全麻和無菌條件下，用18號骨髓穿刺針筒于Beagle犬髂前上嵴抽取新鮮骨髓4～5 mL，迅速加入含肝素的無菌離心管中，1 500 r·min-1離心10 min，在超凈工作臺內(nèi)小心吸棄上層脂肪懸液，加入DMEM 20 mL吹打均勻后平均接種于兩個直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞在培養(yǎng)皿底部形成克隆時進行初次換液，細胞在培養(yǎng)皿底部融合超過70%～80%時首次傳代。從第1代開始，換用添加成骨細胞誘導體系（包括0.1 μmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-磷酸甘油鈉、50 μg·mL-1維生素C）的DMEM培養(yǎng)細胞[5]，選擇第2～3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.4.2 BMSCs與支架材料的體外復合培養(yǎng) 選擇第2～3代細胞，0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集、離心并調(diào)整細胞密度為每毫升1×106。滅菌支架材料分3組：A組為CPC，B組為TCP，C組為PLGA；另設單純培養(yǎng)細胞組作為對照（D組）。分別取支架材料預置于24孔板內(nèi)，根據(jù)材料吸水度預實驗的結(jié)果，每塊材料滴加150 μL細胞懸液，共同培養(yǎng)24 h后加常量培養(yǎng)基，于不同時間點進行后續(xù)檢測。

1.4.3 IPCM觀察 逐日觀察并記錄各組支架材料表面BMSCs外觀形態(tài)的變化及其貼壁、生長、擴增、分化、融合、鈣化等狀況。

1.4.4 生長曲線測定 細胞與支架材料共同培養(yǎng)后，每天從每組材料中取一塊材料用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞并調(diào)節(jié)成1 mL細胞懸液后進行細胞計數(shù)。每組材料重復操作3次取平均值，繪制生長曲線，并進行統(tǒng)計學分析。剩余孔每3天換液。

1.4.5 ALP活性半定量檢測 分別于共同培養(yǎng)7、10、14 d后將樣本從培養(yǎng)液中取出，消化收集細胞，加入裂解液200 μL裂解4～6 h，震蕩30 min后取10 μL放入96孔板中，每組設3個復孔，每孔加入200 μL蛋白質(zhì)分析液后震蕩5 min，630 nm處測光密度（optical density，OD）值。取100 μL細胞懸液放入96孔板，加入膠囊（ALP試劑盒里的固有組分）加緩沖液配成的反應底物100 μL，37℃水浴30 min后置于酶標儀上于405 nm波長下測定OD值。

1.4.6 骨鈣素ARS染色 分別于共同培養(yǎng)14、21 d后將各組材料樣本從培養(yǎng)液中取出，PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次，每次5 min，加0.1%ARS-Tris-HCl（pH值為8.3）于37℃水浴30 min，雙蒸水沖洗干凈多余染色劑后于光學顯微鏡下觀察鈣鹽沉積及鈣結(jié)節(jié)生成情況。

1.4.7 骨鈣素半定量檢測 分別于共培養(yǎng)14、21 d后將3組材料從培養(yǎng)液中取出，PBS沖洗2次，70%乙醇固定1 h，PBS沖洗5次，每次5 min，0.5%ARSTris-HCl（pH值為4.0～4.2）室溫染色1 h后PBS孵育15 min，棄上清液后PBS沖洗3次，每次5 min，棄上清液后加入氯化十六烷基吡啶室溫下孵育30 min，吸上清液，定樣本的OD值（波長562 nm）。測定時用氯化十六烷基吡啶溶液調(diào)零，并同時測一組未加ARS的單純細胞的上清液OD值。樣本OD值=樣本OD測定值-單純細胞上清液OD值。每個樣本重復3次取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 17.0軟件對檢測結(jié)果進行方差分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IPCM觀察

初次換液可見BMSCs呈圓形半透明狀，貼壁生長、增殖并形成散在克隆。BMSCs逐日增殖，約10 d后接近鋪滿培養(yǎng)皿底部，此時可進行首次傳代。換用誘導型DMEM培養(yǎng)后，細胞慢慢向梭形或多邊形轉(zhuǎn)化，偶有突起，形態(tài)類似成骨細胞。接種于不同材料上的細胞均可在材料表面黏附并生長，共同培養(yǎng)72 h后形態(tài)如下：CPC組BMSCs較為伸展，形態(tài)與單純培養(yǎng)組細胞相似；PLGA組BMSCs多為球形，生長狀態(tài)較差；TCP組BMSCs形態(tài)介于上述兩者之間，更接近于CPC組；散落在24孔板底壁細胞的生長形態(tài)與單純培養(yǎng)組細胞的鏡下形態(tài)相似（圖1）。

圖 1 共同培養(yǎng)72 h后BMSCs形態(tài) IPCM ×40Fig 1 Morphological characters of BMSCs cultured 72 h IPCM ×40

2.2 生長曲線測定

BMSCs接種于支架材料上后，部分黏附于材料上開始生長、增殖，部分漏出在培養(yǎng)板底壁繼續(xù)生長。細胞的生長曲線見圖2：黏附于材料上的細胞數(shù)量隨著時間的增加而增加，呈時間依賴性，7 d后進入平臺期，其后增長趨勢減慢；CPC組細胞數(shù)量最多，其次是TCP組，但兩者之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PLGA組細胞數(shù)量最少，與其他兩組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。該結(jié)果提示CPC材料黏附的細胞最多、細胞增殖最快。

圖 2 BMSCs的生長曲線Fig 2 Growth curves of BMSCs

2.3 ALP活性半定量檢測

ALP活性半定量檢測結(jié)果見表1：CPC、TCP、PLGA組細胞均從7 d起表達出明顯的ALP活性，隨著培養(yǎng)時間的延長，ALP活性增強；CPC、TCP組ALP表達強度大于PLGA組，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但CPC與TCP組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表 1 ALP活性半定量測定（OD值）Tab 1 Semi-quantitative measurement（OD value）of ALP ±s

表 1 ALP活性半定量測定（OD值）Tab 1 Semi-quantitative measurement（OD value）of ALP ±s

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2.4 骨鈣素ARS染色

BMSCs在支架材料表面重疊生長，出現(xiàn)基質(zhì)堆積和礦鹽沉積現(xiàn)象。培養(yǎng)14 d時，鈣結(jié)節(jié)ARS染色可見深淺不一的淺紫紅色著色，表明有明顯的鈣鹽沉積；培養(yǎng)21 d時可見多個形態(tài)各異、大小不一的紫紅色結(jié)節(jié)，為鈣鹽沉積形成的鈣結(jié)節(jié)；隨著培養(yǎng)時間的延長，鈣結(jié)節(jié)逐漸增大（圖3）。無論是鈣鹽沉積還是鈣結(jié)節(jié)生成，CPC和TCP組均明顯多于PLGA組（P＜0.05），而CPC和TCP組之間的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖 3 3組的骨鈣素染色情況 ARS ×40Fig 3 Osteocalcin staining of three groups ARS ×40

2.5 骨鈣素半定量檢測

骨鈣素半定量檢測結(jié)果見圖4：14 d后各組細胞均有鈣鹽沉積，PLGA組鈣鹽沉積量明顯少于CPC和TCP組（P＜0.05），而TCP和CPC組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；21 d后各組細胞鈣鹽沉積量明顯增加，無論是鈣鹽沉積還是鈣結(jié)節(jié)生成，CPC和TCP組均明顯多于PLGA組（P＜0.05），而CPC和TCP組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。該結(jié)果與鈣結(jié)節(jié)ARS染色鏡下觀察結(jié)果一致。

圖 4 骨鈣素半定量檢測結(jié)果Fig 4 Semi-quantitative measurement of osteocalcin

3 討論

目前對骨組織工程中支架材料的研究熱點集中于以CPC和TCP為代表的多孔無機支架材料、PLGA與聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）等可降解材料及兩者的復合類材料[3-5]。20世紀80年代，Brown等[6]發(fā)現(xiàn)：某些磷酸鈣鹽能在人體環(huán)境和溫度下自行不放熱固化為羥磷灰石，由此開始將其嘗試用于骨缺損修復。本實驗選擇上海瑞邦生物材料有限公司生產(chǎn)的新型CPC作為支架材料，與PLGA和TCP進行比較。該材料利用成孔劑的微溶解和產(chǎn)氣劑的產(chǎn)氣在常溫下制備出多孔固化物，并針對傳統(tǒng)CPC抗壓強度不足、降解速率過慢等不足，調(diào)整材料的制備條件、漿體微結(jié)構(gòu)、孔徑和孔隙率等，并加以改性制成，有孔徑大（為300～500 μm）、孔隙率高（約為70%）、抗壓強度接近骨松質(zhì)等特性，符合組織工程對于支架材料的要求。

對于種子細胞，不僅要求方便、易得，而且要求具有明確的成骨潛能[2-5]。目前已有多項關于脂肪干細胞、肌肉干細胞、牙髓干細胞、誘導多能干細胞等應用于骨組織工程的研究[7-9]，但BMSCs具有明確的多向轉(zhuǎn)化潛能，可以通過簡單的骨髓穿刺獲得，培養(yǎng)時可貼壁生長以避免接觸抑制，這些優(yōu)勢使其仍是重要的組織工程種子細胞之一。本實驗參考其他學者[10-12]的研究，采用經(jīng)典的全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法獲得具有干細胞特征的種子細胞，進行材料與細胞的復合實驗研究。

本實驗將CPC等支架材料與BMSCs體外共同培養(yǎng)，通過觀察細胞形態(tài)、繪制生長曲線，以及測定ALP和鈣結(jié)節(jié)等方法檢測新型CPC作為骨組織工程支架材料對BMSCs黏附、增殖及成骨分化的影響。通過觀察細胞形態(tài)與生長曲線可以看出：黏附于新型CPC支架上的BMSCs形態(tài)較為伸展，與單純培養(yǎng)組細胞相似，表明CPC支架材料對BMSCs的生長沒有明顯影響；PLGA組表面細胞多為球形，生長狀態(tài)較差，可能是因為降解過程中的中間產(chǎn)物造成的無菌性炎癥以及局部pH值的劇烈變化等原因阻礙了BMSCs的黏附與增殖；TCP組細胞形態(tài)和生長曲線都接近于CPC組，兩組沒有明顯差異，說明TCP對BMSCs的黏附、生長影響較小。

ALP是成熟骨細胞的早期標志物[13]。本研究ALP檢測結(jié)果表明：雖然CPC、TCP、PLGA組細胞均從培養(yǎng)第7天起明顯表達ALP活性，隨著時間增長活性均增強，但每個時間點CPC與TCP組細胞的ALP表達強度均大于PLGA組（P＜0.05），而CPC與TCP組之間則無明顯差異（P＞0.05）。鈣結(jié)節(jié)是成骨細胞分化成熟的標志，由鈣鹽逐步沉積而形成，一般鈣化早期開始表達，成熟后達高峰[14]。本實驗ARS染色結(jié)果同樣表明：無論是鈣鹽沉積還是鈣結(jié)節(jié)生成，CPC組和TCP組均明顯多于PLGA組，而CPC組和TCP組之間沒有顯著差異。鈣結(jié)節(jié)隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增大，半定量檢測結(jié)果顯示：PLGA組鈣結(jié)節(jié)形成明顯少于CPC組和TCP組，而TCP組與CPC組無明顯差異。這一結(jié)果與ARS染色結(jié)果一致。

支架材料是細胞黏附、生長和礦化的場所。理想的骨支架材料要求具備以下特征：1）良好的生物相容性和表面活性，周圍組織炎性反應小；2）具有可控且適宜的生物降解速度，最好與骨的生理性生成相匹配；3）具有合適的孔徑、適當?shù)目紫堵屎蜐B透性；4）具有良好的骨傳導性和骨誘導性；5）材料表面有利于細胞黏附和增殖[15]。本實驗選用的新型CPC孔徑為300～500 μm，孔隙率約70%，且孔與孔之間互相連通，呈現(xiàn)較為規(guī)則的三維多孔隙立體結(jié)構(gòu)，符合骨組織工程支架材料的要求。與BMSCs共同培養(yǎng)后，經(jīng)多項檢測也表明：新型CPC材料為種子細胞的爬行長入、黏附、增殖及成骨作用的發(fā)揮提供了良好的三維空間環(huán)境。這也證明了BMSCs作為干細胞的成骨分化潛能和在組織工程化骨的構(gòu)建中作為種子細胞的可行性。

本實驗結(jié)果證明：新型CPC支架材料可以為種子細胞的生長提供適宜的局部環(huán)境，BMSCs可以在材料表面黏附、增殖、分化并發(fā)揮其成骨潛能。在現(xiàn)有的骨組織工程技術(shù)條件下，可以通過對Beagle犬BMSCs進行體外培養(yǎng)、誘導、擴增，并與新型CPC支架材料共同培養(yǎng)構(gòu)建三維組織工程化骨。但就最終的體內(nèi)植入而言，該類CPC材料還存在脆性較大、骨引導和骨誘導性不足等缺陷，應用基因重組、復合生長因子等高新技術(shù)以體外構(gòu)建具有骨引導性和骨誘導性的真正意義上的三維結(jié)構(gòu)組織工程化骨尚需要更為深入的研究[11-12]。

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