食源性蛋白質(zhì)自組裝纖維的研究進(jìn)展

馮金鳳，劉春紅，馮志彪，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江哈爾濱150030)

近年來，食品科學(xué)家利用自組裝技術(shù)開始構(gòu)建各種納米(微米)級(jí)尺度的功能性結(jié)構(gòu)，如納米纖維、納米管及納米水凝膠等，并開始應(yīng)用于穩(wěn)定食品體系、輸送載體及風(fēng)味控釋等方向［1］。食源性蛋白質(zhì)具有良好的生物相容性，可在消化系統(tǒng)內(nèi)被降解，同時(shí)具有獨(dú)特的自組裝特性，可在特定條件下形成纖維狀結(jié)構(gòu)，有望成為新一代的功能性材料應(yīng)用于食品工業(yè)。自組裝是一種普遍存在于生命科學(xué)體系中的現(xiàn)象，所謂自組裝是指分子、納米、微米或更大尺度的物質(zhì)等基本構(gòu)建單元自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)的過程。1981年美國(guó)麻省理工學(xué)院的Eric Drexler最早提出采用自下而上式(bottom-up)構(gòu)建納米材料的方法，且指出以蛋白質(zhì)為構(gòu)建單元通過自組裝能形成高度有序的結(jié)構(gòu)［2］。Pallarès I等［3］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)自組裝纖維并不為少數(shù)病原性蛋白質(zhì)所特有，與淀粉樣纖維無關(guān)的蛋白質(zhì)同樣能聚集形成纖維狀結(jié)構(gòu)。一些食源性蛋白質(zhì)如 β-乳球蛋白［4-7］、牛血清白蛋白［8］、雞蛋清溶菌酶［9］、大豆蛋白［10-11］、蕓豆蛋白［12-13］等均可在低pH和低離子強(qiáng)度條件下，在變性溫度以上通過加熱自組裝形成纖維結(jié)構(gòu)。本文主要闡述了食源性蛋白質(zhì)自組裝纖維的形成機(jī)制和自組裝纖維過程的表征方法，以期為新型納米材料在食品工業(yè)中的具體應(yīng)用提供理論支持。

1 自組裝纖維的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

蛋白質(zhì)在加熱條件下可以形成纖維狀結(jié)構(gòu)，纖維的結(jié)構(gòu)決定其功能。如圖1為β-乳球蛋白溶液在pH2、80℃下加熱數(shù)小時(shí)后形成的纖維透射電子顯微鏡(TEM)負(fù)染照片［14］。纖維的長(zhǎng)度通常在 1～10μm之間，寬度約10nm，其線性的長(zhǎng)寬比甚至可達(dá)500∶1。較大的長(zhǎng)寬比例是纖維狀結(jié)構(gòu)的最大特點(diǎn)，一方面，可使纖維在較低的濃度下形成充滿空間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使其成為一種有效的填充劑;另一方面，較大的長(zhǎng)寬比例有效地改善了溶液黏性，使得纖維在較低濃度下具有高的儲(chǔ)能模量，這使其成為一種良好的食品添加劑，如在溶液中添加少量的原料蛋白就可達(dá)到好的膠凝和增稠效果。最近的研究表明，纖維的機(jī)械強(qiáng)度取決于組成纖維的股數(shù)，在特定條件下，多股纖維的直徑可達(dá)180nm［15-16］。

2 自組裝纖維的形成條件及作用機(jī)制

在食品體系中，球狀蛋白的自組裝通常是在強(qiáng)酸環(huán)境中進(jìn)行的，此時(shí)的pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，球狀蛋白質(zhì)之間的靜電排斥作用很強(qiáng)。當(dāng)溶液的溫度高于變性溫度時(shí)，加熱使球蛋白變性，更多的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用增強(qiáng)，疏水相互作用與靜電排斥作用達(dá)到平衡，促使了纖維的形成［17］。

圖1 β-乳球蛋白構(gòu)建纖維的TEM照片F(xiàn)ig.1 TEM micrograph of protein fibrils derived from β-Lactoglobulin

目前，普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)自組裝纖維化的形成機(jī)制為成核過程［18-20］。具體機(jī)制如圖 2 所示［21］，蛋白質(zhì)濃度達(dá)到一定的臨界濃度是自組裝過程發(fā)生的前提條件，否則加熱時(shí)間再長(zhǎng)蛋白質(zhì)自組裝纖維化反應(yīng)也不會(huì)發(fā)生。蛋白質(zhì)的自組裝纖維化需要一定的“滯后時(shí)間”，稱為遲滯期，對(duì)應(yīng)圖中A，在此期間緩慢形成一個(gè)有序的核心，成核是纖維形成的限速步驟;晶核形成后由于連接位點(diǎn)的增多，蛋白質(zhì)單體很容易連接到晶核上，呈現(xiàn)快速生長(zhǎng)或聚集過程，如果在超過蛋白質(zhì)的臨界聚集濃度的溶液中加入一些晶核(或“種子”)，加速蛋白質(zhì)的纖維化進(jìn)程，對(duì)應(yīng)圖中B;C表示自組裝形成了纖維。Bolder［22］研究了攪拌與加入晶種對(duì)乳清分離蛋白形成纖維的影響，結(jié)果表明:添加晶種對(duì)纖維的形成影響效果不如攪拌作用明顯，且提出纖維的形成有以下四個(gè)過程:活化、成核、生長(zhǎng)、終止?；罨c成核是纖維形成的限速步驟，纖維快速生長(zhǎng)，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間加熱，蛋白質(zhì)單體鈍化結(jié)果導(dǎo)致纖維形成終止。

圖2 蛋白質(zhì)自組裝纖維形成的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves of self-assembly of proteins into fibrils

Ardy和Loveday等人研究了β-乳球蛋白在pH2時(shí)不同溫度下(353～383K)加熱不同時(shí)間熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果顯示，在所有的溫度條件下，硫黃素T(ThioflavinT，ThT)熒光光譜均呈“S”型曲線，較長(zhǎng)的初始時(shí)間內(nèi)ThT熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，為淀粉樣自組裝纖維化的遲滯期，即成核階段所需時(shí)間較長(zhǎng)。隨后熒光強(qiáng)度突然增大，為淀粉樣纖維化的生長(zhǎng)期，即成核階段，后期熒光強(qiáng)度出現(xiàn)穩(wěn)定的波動(dòng)，即穩(wěn)定階段，這證實(shí)了蛋白質(zhì)自組裝纖維化的成核機(jī)制［5，23］。

反應(yīng)時(shí)間影響反應(yīng)的可逆性與不可逆性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)自組裝纖維的形成。蛋白質(zhì)自組裝纖維化有兩種途徑(圖3所示)。一種途徑是蛋白質(zhì)加熱先變性隨即自組裝形成纖維;另一種途徑是加熱變性后的蛋白質(zhì)繼續(xù)進(jìn)行酸水解反應(yīng)，部分水解多肽自組裝形 成纖維。Bolder［22］和 Akkermans［15］等人 在pH2條件下加熱乳清分離蛋白，利用高效液相色譜法(HPLC)和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析了加熱過程中蛋白質(zhì)分子量的變化，結(jié)果表明，纖維由蛋白質(zhì)酸水解的多肽組成，而不是由完整的蛋白質(zhì)分子組成。

圖3 蛋白質(zhì)自組裝纖維化的兩種途徑Fig.3 Two possible routes for fibrillisation of proteins self-assemble

Akkermans［24］研究了在 pH8，37℃ 條件下，β-乳球蛋白經(jīng)天冬酰胺肽鏈內(nèi)切蛋白酶處理，再將水解液的pH調(diào)到2，用透射電子顯微鏡(TEM)和ThT熒光測(cè)定觀察到長(zhǎng)的纖維狀聚集物，進(jìn)一步證實(shí)了形成纖維狀聚集物的構(gòu)建單元是肽而不是完整的蛋白質(zhì)分子。此外，只有將水解液的pH調(diào)整為2左右時(shí)，多肽才能聚集形成纖維，而pH為8時(shí)卻不能形成纖維，這說明肽的正電荷是形成纖維狀聚集物的重要原因。綜合以上研究結(jié)果推測(cè):纖維形成的共同特點(diǎn)可能是蛋白質(zhì)水解，部分水解多肽片段自組裝形成纖維。目前為止，完整的蛋白質(zhì)能否形成纖維，以及如果能形成纖維所需要的具體環(huán)境條件，還沒有明確的答案。

2010 年 Tang等［13］在 pH2、離子強(qiáng)度 20mmol/L、85℃下，將蕓豆球蛋白加熱15～720min，發(fā)現(xiàn)自組裝形成纖維至少經(jīng)歷三個(gè)步驟(圖4所示)。首先，蕓豆球蛋白的熱誘導(dǎo)變性和聚集(包括無定形聚集和纖維化聚集)，此過程較短(約15min)，原因是加熱溫度高于pH2下蕓豆球蛋白質(zhì)的變性溫度，且變性和聚集的過程中蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化;然后，可能由于疏水作用與靜電斥力的平衡作用，酸水解釋放的多肽片段聚集形成纖維，為多肽水解或自組裝纖維形成的初期，此步驟中，由于β-折疊含量的逐漸增加使得有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)重新排列，使得釋放的多肽片段更多地參與到纖維的形成過程中;最后，形成的纖維在加熱時(shí)間超過360min時(shí)發(fā)生團(tuán)聚。

3 自組裝纖維化過程的表征

3.1 自組裝纖維的生長(zhǎng)檢測(cè)

圖4 蕓豆蛋白自組裝纖維形成的機(jī)理示意圖Fig.4 Schematic illustration for the formation of fibrils from kidney bean proteins self-assemble

硫黃素T是一種能和蛋白質(zhì)淀粉樣纖維特異性結(jié)合的陽離子苯并噻唑熒光染料。Biancalana等［25］研究表明，ThT通過與淀粉樣纖維的β-折疊結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，在440nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下產(chǎn)生480nm的特征熒光發(fā)射峰，且結(jié)合后的熒光強(qiáng)度隨著β-折疊結(jié)構(gòu)數(shù)量的增多而增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)說明蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子β-折疊結(jié)構(gòu)數(shù)量增加，分子內(nèi)部交聯(lián)形成蛋白質(zhì)的纖維化結(jié)構(gòu)。因此，可以通過ThT熒光強(qiáng)度的變化情況，判斷淀粉樣纖維的成熟情況，這是檢測(cè)淀粉樣纖維形成過程的一種典型方法。

Wang等［10］研究了大豆7S球蛋白(也稱β-伴大豆球蛋白)的三個(gè)主要亞基α＇-亞基、α-亞基、β-亞基在85℃、pH2條件下加熱0～20h的熒光光譜圖，結(jié)果表明，三個(gè)亞基的熒光強(qiáng)度均隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增強(qiáng)，表明加熱過程中形成了成熟的纖維結(jié)構(gòu)，但不同的大豆7S球蛋白的3個(gè)亞基熒光強(qiáng)度變化的峰值不同。加熱相同時(shí)間，α＇-亞基的峰值最高，其次依次為β-亞基、α-亞基，這表明在相同加熱條件下，α＇-亞基比β-亞基和α-亞基更容易形成自組裝纖維化聚集。

3.2 自組裝纖維形態(tài)的表征

原子力顯微鏡是在分子水平上探測(cè)表面形貌最先進(jìn)的測(cè)試工具之一，它能提供蛋白質(zhì)纖維化聚集的結(jié)構(gòu)變化信息，包括長(zhǎng)度、寬度以及螺距等，且能充分說明自組裝纖維的形成和結(jié)構(gòu)特征。透射電子顯微鏡與原子力顯微鏡相比，更容易得到同一個(gè)樣品中較好的代表樣品高度與特征形貌等信息的圖片。因此，常利用原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡相結(jié)合來研究蛋白質(zhì)自組裝纖維的長(zhǎng)度與微觀形態(tài)。

Oboroceanu等［7］采用原子力顯微鏡(AFM)研究了β-乳球蛋白在80℃下加熱0～20h的過程中自組裝形成纖維的情況，結(jié)果表明:0～85min內(nèi)，β-乳球蛋白單體變形、伸展形成聚集物;85min后，形成具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的纖維，伸直長(zhǎng)度大于 10μm。Oboroceanu等又采用TEM進(jìn)一步確認(rèn)了β-乳球蛋白的纖維形貌。

Tang 等［11］也采用 AFM 研究了大豆 7S、11S 球蛋白以及兩者1∶1的混合蛋白在pH2、80℃下加熱不同時(shí)間自組裝形成纖維的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，研究表明，所有的大豆球蛋白形成的纖維均為類似的扭曲螺旋結(jié)構(gòu)，但結(jié)構(gòu)特性及纖維的形貌相差很大:7S球蛋白形成高度約為1.4～1.8nm的“蠕蟲狀”纖維;11S球蛋白則形成高度約為1.6～2.2nm的“輻射狀”纖維，甚至聚集成束;且7S球蛋白形成的纖維半峰寬低于11S球蛋白，而混合蛋白的螺旋周期明顯高于7S球蛋白。蛋白形成的纖維結(jié)構(gòu)及形貌的差異可能由于蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)不同造成的。

3.3 自組裝纖維化過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

圓二色譜法(CD)是研究溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種有效技術(shù)，它的優(yōu)勢(shì)是能夠從一系列的光譜區(qū)域內(nèi)獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息［26］。傅利葉變換紅外光譜技術(shù)(FTIR)屬于振動(dòng)光譜，酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶構(gòu)象中α-螺旋和β-折疊分別對(duì)應(yīng)特定的吸收峰，峰值隨著構(gòu)象變化而發(fā)生改變，能動(dòng)態(tài)地跟蹤蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的過程［27］。因此，可以將CD和FTIR光譜結(jié)合起來研究蛋白質(zhì)自組裝纖維化過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

Tang等［11］利用 CD 法研究了大豆 7S、11S 球蛋白以及二者1∶1的混合蛋白在pH2、80℃下加熱過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，在加熱的最初4h內(nèi)，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化很大，繼續(xù)加熱至12h，變化緩慢，此時(shí)可能形成β-折疊。結(jié)果還表明，大豆7S球蛋白比11S球蛋白更容易引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

Oboroceanu 等［7］研究了 β-乳球蛋白在 pH2、80℃下加熱0～20h，利用紅外光譜技術(shù)監(jiān)測(cè)形成的纖維的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，α-螺旋含量下降，β-折疊含量增加。

3.4 自組裝纖維化過程中粒徑分布變化

動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)是一種可以對(duì)蛋白質(zhì)聚集程度做定性分析的方法，對(duì)溶液中的微小聚集顆粒反應(yīng)非常靈敏，當(dāng)溶液中存在大于單體分子的顆粒時(shí)，掃描波長(zhǎng)發(fā)生變化，散射的光密度與聚集顆粒的質(zhì)量和數(shù)量成正比例關(guān)系，且聚集顆粒比單體顆粒散射更多的光［28］。與透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡相比，動(dòng)態(tài)光散射法是從整體角度表征溶液中蛋白質(zhì)粒徑尺寸及平均分布等信息。因此，可以根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量的溶液中平均粒徑分布的變化來表征蛋白質(zhì)自組裝纖維化的動(dòng)態(tài)過程。

Wang等［10］利用DLS監(jiān)測(cè)了7S球蛋白以及其三個(gè)主要亞基 α＇-亞基、α-亞基、β-亞基在 pH2、85℃條件下加熱的聚集過程，結(jié)果表明，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，它們的散射強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致。在反應(yīng)初期，加熱均導(dǎo)致散射強(qiáng)度降低，這可能是由于此時(shí)7S球蛋白以及它的三個(gè)亞基多肽酸水解轉(zhuǎn)化為片段，繼續(xù)加熱，散射強(qiáng)度明顯增大。

Bolisetty等［29］利用 DLS 研究了 pH2、80℃ 加熱β-乳球蛋白，發(fā)現(xiàn)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)單體顆粒的數(shù)量減少，平均粒徑較大的顆粒數(shù)量逐漸增多。這進(jìn)一步證實(shí)了蛋白纖維聚集體的形成過程。

3.5 自組裝纖維化過程中蛋白質(zhì)分子量的變化

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)和分子排阻色譜法(SEC)是兩種常規(guī)測(cè)定分子量的方法，可以分別測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量及完整蛋白質(zhì)分子的分子量，而質(zhì)譜分析法(MS)是目前測(cè)定蛋白質(zhì)分子量最新的方法之一。因此，可以將三種方法結(jié)合起來測(cè)定自組裝纖維化過程中蛋白質(zhì)分子量的變化。

Akkermans等［15］在 pH2，85℃ 條件下加熱 β-乳球蛋白，利用高效分子排阻色譜(HP-SEC)、MS、SDS-PAGE分析了加熱過程中蛋白質(zhì)分子量的變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)β-乳球蛋白加熱至20h時(shí)，多肽分子量分布在2000u到8000u之間，纖維由此分子量的多肽組成，而不是完整的蛋白質(zhì)分子。Bolder等［14］利用SDS-PAGE分析了乳清分離蛋白在pH2、80℃加熱過程中蛋白分子量的變化，也得到類似的結(jié)論。

4 自組裝纖維在食品中的潛在應(yīng)用

食源性蛋白質(zhì)自組裝形成的纖維呈細(xì)長(zhǎng)狀且纖維的長(zhǎng)度與直徑的比例很大，在食品中有許多潛在的應(yīng)用價(jià)值。Akkermans等［30］添加纖維到乳清分離蛋白中，發(fā)現(xiàn)溶液的黏度和膠凝性均增強(qiáng)，表明纖維適合作為良好的增稠劑和膠凝劑應(yīng)用在食品中。由于纖維增加了溶液的黏度，減緩了液體的流動(dòng)性，且能在氣泡周圍覆蓋一層膜，因此可用作泡沫穩(wěn)定劑。在合適的濃度范圍內(nèi)，纖維還可作為有效的絮凝劑使用。在乳狀液中，纖維可以在水與油的界面形成膜。纖維的這種特性也可用于微膠囊的生產(chǎn)，多層纖維通過沉積在水包油乳狀液油滴的表面，可在透氣性與機(jī)械強(qiáng)度方面具有特殊的包埋功能［31-34］。

乳清蛋白中的主要成分β-乳球蛋白的致敏性問題是嬰幼兒奶粉生產(chǎn)中亟需解決的問題。最近研究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白纖維可作為β-乳球蛋白的替代物應(yīng)用在食品中，降低由于β-乳球蛋白胃腸道消化產(chǎn)生的致敏性所致的營(yíng)養(yǎng)成分的損失。Astwood指出酶處理的蛋白質(zhì)在胃環(huán)境中越穩(wěn)定，食物到達(dá)腸粘膜后引起致敏性的可能性就越大［35］。最近的研究顯示經(jīng)胃蛋白酶處理的β-乳球蛋白纖維在胃中僅需要2min的時(shí)間即可消化，大大降低了乳類制品中β-乳球蛋白產(chǎn)生的致敏性，提高了食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［36］。

5 結(jié)語

食源性蛋白質(zhì)在特定的變性條件下自組裝能形成納米纖維狀結(jié)構(gòu)，掌握纖維的形成條件、形成機(jī)理并選擇恰當(dāng)?shù)谋碚鞣椒ūO(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)自組裝纖維化聚集的過程，為纖維以一種新型納米材料應(yīng)用于食品工業(yè)中做鋪墊。但其自組裝技術(shù)在研究與應(yīng)用方面還存在很多問題與挑戰(zhàn)，自組裝機(jī)理方面的研究有待于進(jìn)一步探討，此外，該方向的研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，成本昂貴及耗時(shí)限制了納米材料的大規(guī)模合成與應(yīng)用。因此，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基礎(chǔ)理論研究的深入，蛋白質(zhì)自組裝合成的納米材料將進(jìn)一步推動(dòng)食品科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及生物納米技術(shù)的發(fā)展。

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