致乳糜瀉小麥麩質(zhì)檢測方法研究進展

朱曉燕，袁娟麗，陳紅兵，高金燕

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047;3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330047;4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047)

小麥?zhǔn)鞘澜缟弦环N主要的經(jīng)濟作物，富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等，具有較高的營養(yǎng)價值，在日常飲食中深受人們的喜愛。但同時，小麥也是一種嚴重的食物過敏原，可以引發(fā)多種過敏性疾病，如哮喘、運動激發(fā)過敏癥、蕁麻疹以及乳糜瀉等［1-2］。其中，乳糜瀉是遺傳易感者因攝入麩質(zhì)(主要是小麥及其相似谷物的儲藏蛋白)而引發(fā)的慢性小腸炎癥疾病。該病過去被認為是種少見病，且有地域差異，以歐洲，尤其北歐多見，在西方國家的發(fā)病率為0.5%～2%［3-5］，我國近年來也報道了多例乳糜瀉病例［6-7］。由于人們對乳糜瀉認識的不夠，許多患者可能會被誤診為普通腸道疾病。但近年來隨著對該病發(fā)病機制認識的提高和診斷措施的不斷完善，發(fā)現(xiàn)乳糜瀉的患病率較以前明顯增高，且在亞洲國家的發(fā)病率也呈上升趨勢［8］。乳糜瀉臨床特征主要是腸粘膜絨毛萎縮，從而導(dǎo)致營養(yǎng)吸收不良、腹瀉、生長遲緩、貧血、骨質(zhì)疏松等。目前，無麩質(zhì)飲食是乳糜瀉唯一可靠的治療方式。我國是小麥消費大國，小麥?zhǔn)称吩谌粘Ｉ钪邪缪葜匾慕巧?。但這對乳糜瀉患者卻是一個極大的威脅，因為極少量的麩質(zhì)就會導(dǎo)致患病，這將嚴重影響患者的生活質(zhì)量。而且由于食物配料的多樣化，食物的組成變得十分復(fù)雜，除了食品組分中標(biāo)出的人為加入的麩質(zhì)成分外，食品中其它組分以及各種食品在公用設(shè)備使用過程中產(chǎn)生的交叉污染都有可能給乳糜瀉患者帶來危害。因此，小麥、小麥類制品及其它食物中致乳糜瀉小麥麩質(zhì)的檢測顯得尤為重要。

1 小麥中致乳糜瀉蛋白

小麥麩質(zhì)(gluten)已明確為小麥中致乳糜瀉的蛋白，主要包括麥醇溶蛋白(gliadins)和麥谷蛋白(glutenins)，二者大約占小麥仁儲藏蛋白的80%，富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸殘基［9］。其中，半胱氨酸殘基對面團的形成和功能起著重要作用，它主要在蛋白間形成分子間二硫鍵，產(chǎn)生蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而對面團的粘彈性產(chǎn)生重要的影響。

麥醇溶蛋白為單肽鏈，分子量較小，為 30～75ku［10］，通過分子內(nèi)二硫鍵、氫鍵和疏水作用形成球狀結(jié)構(gòu)(如圖1)，無分子間二硫鍵，它賦予面筋延展性，是影響小麥面筋烘烤品質(zhì)的重要因素，主要包含α/β-、γ-、ω-型［11］。其中 α/β-、γ-型醇溶蛋白分子量在30～45ku之間，富含半胱氨酸;ω型醇溶蛋白分子量在45～75ku之間，但半胱氨酸含量較低［12］。

麥谷蛋白(如圖1)則是一類非均質(zhì)的大分子聚合體，包含高分子量蛋白亞基(HMW:80～130ku)和低分子量蛋白亞基(LMW:10～70ku)［9］。其中 HMW亞基又可分為x型和y型亞基，LMW亞基可分為B-，C-和D-型亞基［13］。麥谷蛋白的氨基酸組成多為極性氨基酸，容易發(fā)生聚集作用，主要賦予面團彈性并決定面團的強度。

圖1 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白［14］Fig.1 Schematic image of gliadins and glutenins

小麥麩質(zhì)是乳糜瀉發(fā)生的必要條件，研究發(fā)現(xiàn)在麩質(zhì)蛋白上存在許多特異性T細胞刺激性表位，特別是 α/β、γ-醇溶蛋白，HMW-和 LMW-麥谷蛋白上也存在這些表位［15］。這些特定的表位肽段在腸道粘膜固有層被抗原遞呈細胞表面的HLA-DQ2(或HLA-DQ8)受體識別，然后被呈遞給CD4+T細胞，從而導(dǎo)致細胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致發(fā)?。?6］。另外，麩質(zhì)蛋白富含脯氨酸，這種獨特的結(jié)構(gòu)特性使得麩質(zhì)蛋白不容易被胃腸道消化酶完全降解，而生成一些較大的肽段(如長度為33個堿基的肽段)。這些麩質(zhì)蛋白免疫顯性肽可能在腸道內(nèi)長時間存在，加大了觸發(fā)T細胞反應(yīng)的機率。

2 小麥麩質(zhì)檢測方法

目前乳糜瀉尚無特效療法，所以患者嚴格避免食用含有麩質(zhì)成分的食物是最佳選擇。然而，小麥消費已經(jīng)遍布世界各地，已躋身于三大消費谷物之一。除了制作烘焙食品和意大利面外，麩質(zhì)還被當(dāng)做食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，且麩質(zhì)也被用來制造個人護理用品、營養(yǎng)品和藥品。另外，傳統(tǒng)的無麩質(zhì)產(chǎn)品和不含小麥的產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工以及包裝過程中，還可能受到交叉污染。顯而易見，谷物及谷物片段在食品加工行業(yè)中無處不在。此外，最近一項臨床實驗證實腹腔能夠承受的麩質(zhì)水平是攝入量每天不超過50mg的麩質(zhì)蛋白［17］，但目前麩質(zhì)的最低激發(fā)劑量未見報道［18］。食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission，CAC)規(guī)定無麩質(zhì)食品的麩質(zhì)含量不超過20mg/kg［19］。由此可見，食品中麩質(zhì)含量的準(zhǔn)確檢測，以及無麩質(zhì)食品標(biāo)簽的制定，對于乳糜瀉患者的健康和安全飲食極為重要。迄今為止，用于麩質(zhì)含量檢測的方法主要包括ELISA法，免疫印跡法，質(zhì)譜法，以及PCR法。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法

目前，市場上用于麩質(zhì)定性和定量的方法主要是ELISA法，該法靈敏性高、特異性強、快速、費用低。用于檢測麩質(zhì)的ELISA商業(yè)試劑盒有多種，這些試劑盒主要采用雙抗夾心法，檢出限范圍為2～10mg/kg［20］。但大多數(shù)試劑盒主要是基于 Skerritt抗體［21］和 R5 抗體［22］。Skerritt抗體主要是針對ω-醇溶蛋白，R5抗體則針對廣泛存在于 α/β-、γ-、ω-醇溶蛋白上的表位，包括 QQPFP、QQQFP、LQPFP、QLPFP等。有研究表明，Skerritt抗體對麥谷蛋白的親和力較麥醇溶蛋白高［20，22］，R5 抗體對麥醇溶蛋白的親和力較麥谷蛋白要高［22-23］。但很遺憾，這種親和力差異對麩質(zhì)定量的影響在商業(yè)檢測試劑盒中尚未見報道。

目前，食品法典委員會(CAC)認可的檢測麩質(zhì)含量的方法是基于R5抗體的夾心ELISA法［24］。該法既可以檢測天然的麩質(zhì)蛋白也可以檢測加工過的麩質(zhì)蛋白。但夾心ELISA法也具有局限性，它在檢測過程中需要待檢抗原含有兩個或兩個以上可被R5單抗識別的表位。通常，對于許多水解食物，在加工過程中，蛋白被打斷成碎片，最后可能只剩下一個毒性表位，在這種情況下，麩質(zhì)蛋白仍能導(dǎo)致乳糜瀉的發(fā)生，但卻不易被檢測出。2011年，應(yīng)食品法典委員會的要求，Mena等［25］開發(fā)出了基于R5抗體的競爭抑制性ELISA，該法可以很好的解決上述問題，其檢出限和定量限分別為0.72mg/kg和2.44mg/kg的麥醇溶蛋白。

當(dāng)然，除了商業(yè)試劑盒外，還有許多實驗室的方法用于檢測麩質(zhì)［26-28］。這些方法主要是麩質(zhì)蛋白的提取方法和使用的抗體不同，如 Morón等［26］采用基于 33個堿基肽(LQLQPFPQPQLPYPQPQLP YPQPQLPYPQPQPF)的單抗進行夾心和競爭ELISA，其檢出限分別為1mg/kg和0.5mg/kg的麥醇溶蛋白。秦倩茹等［28］建立了檢測小麥醇溶蛋白的定量夾心ELISA法，采用的抗體為兔抗醇溶蛋白抗體，定量檢出限為7.81mg/kg。此外，還有基于α-、γ-醇溶蛋白肽的單抗和PN3(LGQQQPFPPQQPYPQPQPF)單抗等等，但這些方法均沒有得到食品法典委員會的認可。

迄今為止，現(xiàn)有的檢測麩質(zhì)的ELISA方法仍存在缺陷。主要體現(xiàn)在以下幾個方面:a.重復(fù)性不夠高:ELISA法容易受到板包被、加樣、洗板、反應(yīng)溫度和時間等許多因素影響，因而造成重復(fù)性差;b.易受抗體的影響:由于各種抗體的特異性不同，其檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性和假陰性，甚至出現(xiàn)交叉反應(yīng);c.檢測對象的局限性:目前ELISA商業(yè)試劑盒使用的R5抗體和Skerritt抗體檢測的都是麥醇溶蛋白，而引發(fā)乳糜瀉的T細胞表位不僅存在于麥醇溶蛋白上，麥谷蛋白上也含有。理論而言，這兩種單抗用于檢測致乳糜瀉毒性麩質(zhì)的準(zhǔn)確性不如抗T細胞表位的抗體，但這種差異目前并沒有得到很好的比較研究。

ELISA方法使用的抗體比較關(guān)鍵，其結(jié)果的準(zhǔn)確性關(guān)系到乳糜瀉患者的安全健康飲食?，F(xiàn)存的各種檢測抗體，包括食品法典委員會認可的R5單抗，都存在著許多爭議。目前，并沒有統(tǒng)一的用于檢測麩質(zhì)的抗體，因此，急需開發(fā)出一種能夠準(zhǔn)確定量出致乳糜瀉毒性麩質(zhì)的抗體。

2.2 免疫印跡法

根據(jù)定量免疫印跡的原理，也可以檢測出產(chǎn)品中麩質(zhì)的含量［29-30］。該法主要是結(jié)合SDS-PAGE電泳和免疫印跡。在后期的印跡過程中，也是采用基于麩質(zhì)的各種特異性抗體。如，Van den Broeck等［30］人開發(fā)出了基于T細胞表位的單克隆抗體Glia-α9和Glia-α20，并應(yīng)用于免疫印跡檢測毒性表位。

由于免疫印跡技術(shù)的局限性，如在轉(zhuǎn)膜過程中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印的好壞受多種因素的影響，且需根據(jù)印跡的強弱來確定麩質(zhì)的量。因此，該法在麩質(zhì)蛋白定量的精確性上還有待提高。目前，該法在篩查低致乳糜瀉毒性小麥及其他低乳糜瀉毒性谷物品種方面的應(yīng)用比較多。采用此法，可以較直觀地比較出各品種麩質(zhì)蛋白的種類與含量的差異，也可通過印跡的結(jié)果鑒定各單抗的特異性程度。

2.3 質(zhì)譜法

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是第一個使用非免疫技術(shù)來檢測面粉和食物樣本中麩質(zhì)含量的方法［31］，可以檢測面粉、淀粉類食物中的小麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白、黑麥醇溶蛋白以及燕麥谷蛋白。與其它方法相比，該法同樣需要樣品前處理，但在整個檢測過程中不需要使用抗體，而是直接根據(jù)質(zhì)譜模式圖定量出醇溶蛋白(25～40ku)。該法對于加工或非加工的麥類食品都適用，其檢測線性范圍 4～100mg/kg［31］。但是，MALDI-TOF-MS 法不能很好的檢測出非致乳糜瀉毒性谷物玉米、大米中含有的麥醇溶蛋白，因為大米、玉米本身含有大量的醇溶蛋白，會干擾麥醇溶蛋白質(zhì)譜信號。為了解決這個問題，Hernando等［32］開發(fā)出了兩步法提取出小麥醇溶蛋白，并結(jié)合MALDI-TOF-MS法檢測以玉米、大米為基質(zhì)的食品中麥醇溶蛋白的含量(30～45ku)，該法的檢測線性范圍為100～400mg/kg。

由于質(zhì)譜法用于檢測麩質(zhì)含量低于20～25mg/kg的樣本時，效果不好，因而不適用于低麩質(zhì)水平的食物樣本的檢測。為了克服MS檢測麩質(zhì)的缺陷，Sealey-Voyksner等［33］建立了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)的方法。液質(zhì)聯(lián)用法是一種高效的分析技術(shù)，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點結(jié)合起來，可以從復(fù)雜的食物基質(zhì)中檢測出目標(biāo)蛋白，在谷類蛋白研究方面得到了很好的應(yīng)用。該法主要對各種常見市售麩質(zhì)類食品和無麩質(zhì)食品中與麩質(zhì)密切相關(guān)的六個致敏肽(LQPQNPSQQQPQEQVPL、 TQQPQQPFPQQPQQPFPQ、VPVPQLQPQNPSQQQPQEQVPL、RPQQPYPQPQPQY、QPQQPFPQTQQPQQPFPQ和PQQSPF)進行檢測，其檢測線性范圍為0.01～100mg/kg，檢出限和定量限分別為1～30μg/kg和10～100μg/kg。液質(zhì)聯(lián)用相比于單一的質(zhì)譜法，對于低麩質(zhì)含量的食品檢測具有較好的效果。

質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時進行、質(zhì)量精度高且結(jié)果可靠等優(yōu)點，因而被廣泛運用于化學(xué)、化工、醫(yī)藥、材料、生命科學(xué)等各個領(lǐng)域。但是，與免疫學(xué)檢測方法相比，質(zhì)譜法依賴貴重設(shè)備，費用較高、費時費力，不適用于食品行業(yè)的現(xiàn)場快速、大量檢測。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜法有望突破這些障礙，而廣泛的運用于食品行業(yè)麩質(zhì)蛋白的檢測中。

2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR法)

繼質(zhì)譜法后，又出現(xiàn)了另一種非免疫學(xué)方法—PCR法，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳來檢測麩質(zhì)蛋白的基因［34-35］。這種方法主要是通過體外擴增食品中的目標(biāo)DNA序列，然后確定其是否含有麩質(zhì)蛋白。

Debnath等［34］開發(fā)出的PCR法主要用于定性檢測麥谷蛋白，通過基因擴增，獲得麥谷蛋白135bp基因片段的PCR產(chǎn)物，陽性樣品通過擴增可以呈現(xiàn)135bp的基因片段。該法的檢出限為21.5pg DNA。而柯燕娜等［35］建立了一種常規(guī)PCR法，用于檢測各種原料和加工食品中的小麥麩質(zhì)。該法針對小麥的ω-醇溶蛋白設(shè)計了一對擴增片段大小為185bp的引物，檢出限為10ng。但是，常規(guī)PCR法的缺陷是不能定量出麩質(zhì)含量，而且它檢測的只是單一的麥谷蛋白或麥醇溶蛋白的DNA，具有很大的局限性。

值得欣慰的是，隨著熒光定量PCR(Q-PCR)的介入，該方法被成功地應(yīng)用于檢測食品中小麥麩質(zhì)的DNA含量。Mujico等［36］開發(fā)出了一種Q-PCR系統(tǒng)用于檢測小麥麩質(zhì)蛋白的DNA，其定量限為20pg DNA，并將此法與R5 ELISA法進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了水解和深加工的食品外，對于其它食品，不僅麩質(zhì)含量高于1.5mg/kg(R5 ELISA試劑盒定量限)的食物樣本，而且麩質(zhì)含量低于1.5mg/kg的食物樣本，Q-PCR都可以檢測出陽性信號，表明其敏感性優(yōu)于R5 ELISA法，是檢測食品中是否存在麩質(zhì)的一種有效的非免疫學(xué)方法。

無論是常規(guī)PCR還是Q-PCR，其在檢測食物基質(zhì)復(fù)雜、麩質(zhì)含量低的食品上都具有優(yōu)勢。但是麩質(zhì)成分復(fù)雜，表達該蛋白的基因也相應(yīng)多種多樣，以上兩種方法每次只能檢測某單一蛋白的DNA，且引物的設(shè)計和選擇比較關(guān)鍵，易出現(xiàn)假陽性或假陰性擴增。同時，即使是Q-PCR也只能定量出DNA的含量，并不能直接獲得食物中麩質(zhì)蛋白的準(zhǔn)確含量。

3 結(jié)語

乳糜瀉是一種與小麥消費密切相關(guān)的食物過敏疾病，其發(fā)病率隨著小麥消費量的增加呈上升趨勢。麩質(zhì)蛋白的準(zhǔn)確檢測對于低麩質(zhì)和無麩質(zhì)產(chǎn)品標(biāo)簽的制定至關(guān)重要。同時，也與食品安全控制、標(biāo)示、安全預(yù)警等密切相關(guān)。各種檢測麩質(zhì)蛋白的技術(shù)除可以保障乳糜瀉患者安全消費外，還可運用于其它食物過敏原的檢測，是保障食品安全的支撐技術(shù)?，F(xiàn)有的各種檢測技術(shù)還存在許多缺陷，隨著對乳糜瀉發(fā)病機制以及麩質(zhì)蛋白更進一步的了解，更為準(zhǔn)確、安全、經(jīng)濟、快速、適用性廣、高靈敏性的檢測技術(shù)將會應(yīng)運而生。

［1］Palosuo K.Update on wheat hypersensitivity［J］.Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology，2003，3(3):205-209.

［2］Inomata N.Wheat allergy［J］.Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology，2009，9(3):238-243.

［3］Green P H R，Cellier M D B.Celiac disease［J］.New England Journal of Medicine，2007，357:1731-1743.

［4］Volta U，Bellentani S，Bianchi F B，et al.High prevalence of celiac disease in Italian general population［J］.Digestive Diseases and Sciences，2001，46(7):1500-1505.

［5］Tatar G，Elsurer R，Simsek H，et al.Screening of tissue transglutaminase antibody in healthy blood donors for celiac disease screening in the Turkish population［J］.Digestive Diseases and Sciences，2004，49(9):1479-1484.

［6］孫雪潔，周游，葛偉.淋巴管畸形合并乳糜瀉一例［J］.中華臨床醫(yī)師雜志電子版，2010，4(7):1172-1173.

［7］陳靜.難治性乳糜瀉1 例報道［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(2):207-208.

［8］Catassi C，Cobellis G.Coeliac disease epidemiology is alive and kicking，especially in the developing world［J］.Digestive and Liver Disease，2007，39(10):908-910.

［9］Koning F，Gilissen L，Wijmenga C.Gluten:a two-edged sword，Immunopathogenesis ofceliacdisease［J］.Springer Seminars in Immunopathology，2005，27(2):217-232.

［10］Gianibelli M C，Larroque O R，MacRitchie F，et al.Biochemical，genetic，and molecular characterization of wheat glutenin and its component subunits［J］.Cereal Chemistry Journal，2001，78(6):635-646.

［11］Woychik J H，Boundy J A，Dimler R J.Starch gel electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1961，94(3):477-482.

［12］Shewry P R，Halford N G.Cereal seed storage proteins:structures，properties and role in grain utilization［J］.Journal of Experimental Botany，2002，53(370):947-958.

［13］Jackson E A，Holt L M，Payne P I.Characterisation of high molecular weight gliadin and low molecular weight glutenin subunits of wheat endosperm by two-dimensional electrophoresis and the chromosomal localisation of their controlling genes［J］.Tag Theoretical Applied Genetics，1983，66(1):29-37.

［14］Gong Y H.Proteomics analysis of immuno toxic gluten epitopes for the development of celiac safe wheat by screening synthetic hexaploids of wheat［D］.Netherlands:University of Wageningen，2008.

［15］Stepniak D，Wiesner M，de Ru A H，et al.Large-scale characterization of natural ligands explains the unique glutenbinding properties of HLA-DQ2［J］.The Journal of Immunology，2008，180(5):3268-3278.

［16］Sollid L M.Coeliac disease:Dissecting a complex inflammatory disorder［J］.Nature Reviews Immunology，2002，2:647-655.

［17］Catassi C，F(xiàn)abiani E，Iacono G，et al.A prospective，doubleblind，placebo-controlled trial to establish a safe gluten threshold for patients with celiac disease［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2007，85(1):160-166.

［18］Per?aho M，Kaukinen K，Paasikivi K，et al.Wheat-starchbased gluten-free products in the treatment of newly detected coeliac disease:prospective and randomized study［J］.Alimentary Pharmacology and Therapeutics，2003，17(4):587-594.

［19］Codex AlimentariusCommission.Draftrevised codex standard for foods for special dietary use for persons intolerant to gluten［S］.ALINORM，2008-31-26，Appendix III.

［20］Schubert-Ullrich P，Rudolf J，Ansari P，et al.Commercialized rapid immunoanalytical tests for determination of allergenic food proteins:an overview［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2009，395(1):69-81.

［21］Skerritt J H，Hill A S.Monoclonal antibody sandwich enzyme immunoassays for determination of gluten in foods［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1990，38(8):1771-1778.

［22］Valdés I，García E，Llorente M，et al.Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol［J］.European Journal of Gastroenterology and Hepatology，2003，15(5):465-474.

［23］Kahlenberg F，Sanchez D，Lachmann I，et al.Monoclonal antibody R5 for detection of putatively coeliac-toxic gliadin peptides［J］.European Food Research and Technology，2006，222:78-82.

［24］Codex Alimentarius Commission，programa conjunto FAO/OMS sobre normas alimentarias comisión del codex Alimentarius［S］.ALINORM，2006-29-23.

［25］Mena M C，Lombardía M，Hernando A，et al.Comprehensive analysis of gluten in processed foods using a new extraction method and a competitive ELISA based on the R5 antibody［J］.Talanta，2012，91(15):33-40.

［26］Morón B，Cebolla A，Manyani H，et al.Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2008，87(2):405-414.

［27］Bermudo Redondo M C，Griffin P B，Garzon Ransanz M，et al.Monoclonal antibody-based competitive assay for the sensitive detection of coeliac disease toxic prolamins［J］.Analytica Chimica Acta，2005，551(1-2):105-114.

［28］秦倩茹，高宏偉，馬洪明.過敏原小麥醇溶蛋白ELISA定量檢測方法的建立［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(11):360-365.

［29］Constantin C，Touraev A，Heberle-Bors E，et al.Detection of antigens reactive to IgE and IgA during wheat seed maturation and in different wheat cultivars［J］.International Archives of Allergy and Immunology，2009，149:181-187.

［30］van den Broeck H，Chen H B，Lacaze X，et al.In search of tetraploid wheat accessions reduced in celiac disease-related gluten epitopes［J］.Molecular Bio Systems，2010，6(11):2206-2213.

［31］Camafeita E，Alfonso P，Mothes T，et al.Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-night mass spectrometric microanalysis:the first non-immunological alternative attempt to quantify gluten gliadins in food samples［J］.Journal of Mass Spectrometry，1997，32(9):940-947.

［32］Hernando A，Valdes I，Méndez E.New strategy for the determination of gliadins in maize-or rice-based foods matrixassisted laserdesorption/ionization time-of-?ightmass spectrometry:fractionation of gliadins from maize or rice prolamins by acidic treatment［J］.Journal of Mass Spectrometry，2003，38(8):862-871.

［33］Sealey-Voyksner J A，Khosla C，Voyksner R，et al.Novel aspects of quantitation of immunogenic wheat gluten peptides by liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217(25):4167-4183.

［34］Debnath J，Martin A，Gowda L R.A polymerase chain reaction directed to detect wheat glutenin:Implications for gluten-free labelling［J］.Food Research International，2009，42(7):782-787.

［35］柯燕娜，葛宇，巢強國，等.食品中小麥致敏成分的常規(guī)PCR 檢測方法的建立［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(7):184-187.

［36］Mujico J R，Lombardía M，Mena M C，et al.A highly sensitive real-time PCR system for quantification of wheat contamination in gluten-free food for celiac patients［J］.Food Chemistry，2011，128(3):795-801.