荷葉中荷葉堿及原花青素提取工藝優(yōu)化

張曉玲，周 蕓，熊小鳳，吳永江，欒連軍

(浙江大學現(xiàn)代中藥研究所，浙江杭州310058)

荷葉為睡蓮科(NympHaeaceae)蓮屬(Nelumbo)植物蓮的干燥葉，為藥典收載品種，屬藥食兩用植物。荷葉含生物堿、原花青素及多糖等成分。荷葉中所含生物堿為異喹啉類，如荷葉堿(Nunciferine)、亞美罌粟堿(Armepavine)、原荷葉堿(Pronuciferine)、N-去甲基荷葉堿(N-Nornuciferine)等，具有降脂減肥、抗病毒、抑菌、抗驚厥等藥理作用［1］。原花青素是由(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素及(-)-表兒茶素沒食子酸酯縮合而成的聚合多酚物質(zhì)，具有降脂［2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、保護心肌缺血［5］、改善小鼠記憶［6］等藥理作用。荷葉具有清熱解暑，升發(fā)清陽，涼血止血功效，自古就是減肥佳品，《本草綱目》中有“荷葉服之，令人瘦劣”的記載?，F(xiàn)代藥理學研究表明，荷葉提物有降脂減肥、抗氧化和抑菌等功效，生物堿和多酚為主要有效成分［7］。衛(wèi)生部批準的減肥保健食品中，有16個產(chǎn)品以荷葉為主要原料。已有文獻報道多集中于荷葉生物堿，而對另一類重要成分荷葉原花青素研究較少。本實驗以荷葉原花青素、荷葉堿為指標，優(yōu)選一種適于工業(yè)化生產(chǎn)的荷葉生物堿、原花青素同時提取方法，以最大程度保證荷葉提取物的藥效作用，為荷葉綜合利用與深度開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉藥材 江西南昌濟順藥廠提供，產(chǎn)地山東，批號Z001-20091009;香草醛 分析純，中國上海雙香助劑廠;濃鹽酸 杭州禾德化工有限公司;原花青素對照品 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)公司，純度≥95%;荷葉堿對照品 中國藥品生物制品檢定所，批號111566-200402;甲醇、乙腈 色譜純，默克公司;磷酸、硫酸、冰醋酸 分析純，杭州高晶精細化工有限公司;三乙胺 分析純，天津市永達化學試劑有限公司。

DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;高效液相色譜儀 Agilent 1200;PHS-3C精密pH計 上海日島科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 荷葉堿與原花青素測定方法

1.2.1.1 荷葉堿測定方法 參照2010版藥典收載荷葉項下方法，取荷葉粗粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流2.5h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，注入液相色譜儀，測定峰面積，外標法計算荷葉堿含量。色譜柱:Eelipse XDA-C18柱(4.6mm×250mm，5.0μm);流動相:乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(27∶70.6∶1.6∶0.78);流速:1.0mL·min-1;柱溫:35℃;檢測波長 270nm;進樣量:10μL。

1.2.1.2 原花青素測定方法 取荷葉約20g，精密稱定，料液比1∶25(g/L)，70%乙醇，80℃回流提取三次，每次2.5h，濾過，合并濾液，加水定容至適當體積，測定溶液原花青素的含量。

原花青素的測定采用香草醛-甲醇溶液和鹽酸顯色法［8］，于10mL具塞試管中依次加入1mL不同濃度對照品溶液或樣品溶液，3mL 3%香草醛-甲醇(W/V)溶液及1.5mL濃鹽酸，混勻后于30℃水浴保溫15min，在500nm下測定吸光度(以甲醇代替樣品溶液作為空白對照)。

1.2.2 荷葉中荷葉堿、原花青素提取單因素實驗設計單因素實驗，分別考察提取溶液pH、酸的種類、磷酸濃度、提取時間、料液比、提取溫度、提取次數(shù)對荷葉中荷葉堿和原花青素提取率的影響。

1.2.3 荷葉中荷葉堿、原花青素提取正交實驗 在單因素實驗的基礎上，根據(jù)各單因素對兩種有效成分的影響程度，選擇磷酸濃度、料液比、提取時間三個因素進行正交實驗設計，以確定最佳提取條件。L9(34)正交實驗設計因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉含量測定結(jié)果

經(jīng)測定，荷葉(批號Z001-20091009)中荷葉堿含量為0.45%，原花青素含量為2.5%(n=3)。荷葉堿色譜圖見圖1。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 提取溶劑pH的影響 稱取荷葉20g，以水為提取溶劑，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH3、5、7、9、11，料液比 1∶15(g/L)，95℃加熱提取二次，每次 1h，合并濾液，過濾，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖2。

在實驗設定的pH范圍內(nèi)，荷葉堿提取率隨pH增大而下降，堿性環(huán)境下，提取率明顯偏低。pH對荷葉原花青素的提取率無明顯影響。選擇酸性水溶液作為提取溶劑較為有利。

2.2.2 酸的種類的影響 稱取荷葉20g，料液比1∶15(g/L)，95℃加熱提取二次，每次 1h。提取溶劑分別為:0.1%(V/V)磷酸水、0.1%(V/V)醋酸水、0.1%(V/V)硫酸水。濾過，合并濾液，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖3。

圖1 荷葉堿對照品及荷葉提取液的HPLC圖Fig.1 HPLC Chromatogram of nuciferine and sample solution

圖2 提取溶劑pH對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.2 Effect of pH on transfer rate of procyanidins and nuciferine

圖3 酸種類對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.3 Effect of acid on transfer rate of procyanidins and nuciferine

在0.1%酸濃度情況下，與醋酸水相比，硫酸水、磷酸水中荷葉堿提取率較高，對原花青素提取率影響不大?？紤]到硫酸為易制毒試劑，管制較嚴，購買不便，可選擇磷酸水作為提取溶劑。

2.2.3 磷酸濃度的影響 分別配制0.05%、0.1%、0.15%、0.20%、0.30%、0.40%(V/V)磷酸水溶液。稱取荷葉20g，料液比1∶15(g/L)，加入不同濃度的磷酸水溶液，95℃加熱提取二次，每次1h，濾過，合并濾液，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖4。

圖4 磷酸濃度對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.4 Effect of the volume fraction of acid on transfer rate of procyanidins and nuciferine

在0.05%至0.4%(V/V)磷酸水濃度范圍內(nèi)，隨酸濃度增加，荷葉堿、原花青素的提取率逐漸提高，在0.2%～0.3%左右達到最大，隨后原花青素提取率、荷葉堿提取率均隨著酸濃度升高提取率下降。

2.2.4 提取時間的影響 稱取荷葉20g，料液比1∶15，0.1%(V/V)磷酸水溶液，95℃加熱提取二次，提取時間分別為0.5、1、2、3h。濾過，合并濾液，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on transfer rate of procyanidins and nuciferine

提取1h后，溶液中原花青素、荷葉堿基本達到平衡，提取率基本不再增加?？紤]到原花青素易氧化及熱穩(wěn)定性，提取時間宜控制在1～2h內(nèi)。

2.2.5 料液比的影響 稱取荷葉20g，加0.1%(V/V)磷酸水溶液，95℃加熱提取二次，料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30(g/L)，濾過，合并濾液，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖6。

圖6 料液比對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.6 Effect of material-liquid ratio on transfer rate of procyanidins and nuciferine

原花青素、荷葉堿的提取率隨著料液比的增大而增大，至1∶20(g/L)以上時，提取率升高速度減慢?？紤]到溶劑消耗、生產(chǎn)耗能及后續(xù)濃縮，料液比宜控制在 1∶25(g/L)以內(nèi)。

2.2.6 提取溫度的影響 稱取荷葉20g，料液比1∶15(g/L)，0.1%(V/V)磷酸水溶液，加熱提取二次，每次1h，提取溫度80、90、95、100℃，濾過，合并濾液，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖7。

圖7 提取溫度對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on transfer rate of procyanidins and nuciferine

提取溫度在95～100℃范圍內(nèi)，原花青素、荷葉堿提取率漸趨平穩(wěn)，考慮控制提取溫度在95～100℃之間。

2.2.7 提取次數(shù)的影響 稱取荷葉20g，料液比1∶15(g/L)，0.1%(V/V)磷酸水溶液，95℃加熱提取，每次1h，提取次數(shù)分別為 1、2、3、4、5 次，濾過，合并提取液，測定并計算原花青素和荷葉堿的提取率。結(jié)果見圖8。

圖8 提取次數(shù)對原花青素和荷葉堿提取率的影響Fig.8 Effect of extraction times on transfer rate of procyanidins and nuciferine

荷葉堿、原花青素提取率總體上隨提取次數(shù)增加而增加，在3～4次后基本達到平衡。考慮到提取次數(shù)越多，在工業(yè)生產(chǎn)中會造成溶劑和能源的浪費，所以考慮選擇提取2～3次。

2.3 正交實驗

2.3.1 樣品制備 按照正交表1安排實驗，稱取荷葉藥材20g置于圓底燒瓶中，加入提取溶劑，水浴加熱回流提取二次，趁熱過濾提取液，定容至一定體積，測定原花青素與荷葉堿含量，計算提取率。結(jié)果見表2，方差分析見表3～表4。

由表3～表4分析可知，各因素對荷葉中荷葉堿和原花青素提取率影響主次關系均為:料液比＞磷酸濃度＞提取時間。磷酸濃度(A)對原花青素提取率影響較小，對荷葉堿的提取率影響較大，具有顯著性;料液比(B)對原花青素和荷葉堿的提取率均有顯著影響;提取時間對兩者的影響均不顯著。綜合兩種有效成分提取率確定優(yōu)化工藝條件為A3B3C2，即磷酸濃度為0.3%、料液比1∶25(g/L)、提取時間為1.5h。

表2 荷葉提取正交實驗結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

表3 原花青素正交實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance by procyanidins

表4 荷葉堿正交實驗結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance by nuciferine

2.3.2 驗證實驗 按照A3B3C2最佳工藝條件進行三次重復實驗，結(jié)果表明，原花青素的提取率為89.2%，荷葉堿的提取率為69.9%。

3 結(jié)論

在磷酸濃度為0.3%、料液比1∶25(g/L)、提取時間為1.5h時，原花青素的提取率可達到89.2%，荷葉堿的提取率可達到69.9%，此優(yōu)化條件能明顯提高荷葉生物堿的提取率。原花青素在堿性條件下極易降解，在弱酸性條件下比較穩(wěn)定［9］，因此采用酸水提取法提取荷葉中的兩類有效成分，具有提取效率高、工藝簡便、成本低的優(yōu)勢，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)應用。

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