大豆乳清中淀粉酶的超濾提取技術(shù)研究

陳超琴，趙黎明，蔣麗華，夏泉鳴

(華東理工大學(xué)發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心，華東理工大學(xué)食品科學(xué)與工程系，上海200237)

在大豆分離蛋白生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量乳清廢水，每生產(chǎn)1t大豆分離蛋白，約排放出60～80m3的乳清廢水，大豆乳清廢水的BOD高達(dá)5000～8000mg/L，超出國(guó)家規(guī)定的廢水排放標(biāo)準(zhǔn)的100多倍［1］。目前國(guó)內(nèi)大豆分離蛋白產(chǎn)能約60萬(wàn)t，大豆乳清廢水的處理已經(jīng)成為制約大豆深加工產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。對(duì)大豆乳清廢水的傳統(tǒng)處理方法是直接進(jìn)行厭氧和好氧生物處理以降低廢水中的COD及BOD值，利用微生物來(lái)降解廢水中的有機(jī)物質(zhì)，這樣處理后即使能達(dá)到國(guó)家廢水排放標(biāo)準(zhǔn)，但因?yàn)樘幚沓杀緲O高企業(yè)承受不起，同時(shí)廢水中的大量的有用物質(zhì)也白白浪費(fèi)［2］。目前國(guó)內(nèi)也有企業(yè)通過(guò)將大豆乳清廢水進(jìn)行沼氣發(fā)電進(jìn)行綜合處理利用，但無(wú)論是處理效果還是處理成本，都不能讓企業(yè)滿意。乳清廢水中含有豐富的乳清蛋白、低聚糖等有用物質(zhì)。其中乳清蛋白主要含有Kunitz胰蛋白酶抑制劑、β-淀粉酶和凝集素，其次是Bownma-Birk胰蛋白酶抑制劑、脂肪氧化酶等［3］。近年來(lái)，很多學(xué)者致力于開發(fā)各種先進(jìn)技術(shù)如膜分離技術(shù)、樹脂層析、色譜、超臨界流體萃取、高效液相色譜等技術(shù)來(lái)提取大豆乳清廢水中的有用物質(zhì)如大豆乳清蛋白、大豆低聚糖、大豆異黃酮等，并取得了較好的成果，但是從大豆乳清廢水中提取 β-淀粉酶國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。β-淀粉酶在制備結(jié)晶麥芽糖及麥芽糖醇、飴糖、啤酒、飲料、面包、醬油、白酒等工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程具有重要的作用。本文重點(diǎn)探討了超濾技術(shù)提取大豆乳清中β-淀粉酶的應(yīng)用效果和工藝參數(shù)，為大豆乳清資源化利用提供一些新的思路和方法。

表1 大豆乳清主要成分分析Table 1 Analysis of soybean whey wastewater

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆乳清廢水 山東萬(wàn)得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供;3，5-二硝基水楊酸(DNS)、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、SDS(十二烷基磺酸鈉)、Acr(丙烯酰胺)、Bis(N，N＇-亞甲基雙丙烯酰胺)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、甘氨酸、Aps(過(guò)硫酸氨)溴酚藍(lán)、甘油、冰醋酸、乙醇、b-2-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R250、甲醇、乙醇 均為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;TEMED(四甲基乙二胺)、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(97.4、66.2、43，31、20.1、14.4ku)上海捷瑞生物工程有限公司。

QY-NUF-1812膜設(shè)備、QY-UF-3-T-1812及QY-UF-10-T-1812超濾膜(聚醚砜，有效膜面積:0.24m2)上海齊豫生物科技有限公司;Amicon Ultra-153，10ku MWCO超濾離心管 美國(guó) Millipore公司;5810R離心機(jī) Eppendorf;UV-2000紫外可見光分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;KDN-2C型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;FE20精密pH計(jì) 梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療機(jī)械五廠;SE1501F電子天平(0.1g)奧豪斯儀器(上海)有限公司;電泳儀、垂直電泳槽 Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-淀粉酶活力測(cè)定［4］采用Bernfeld方法測(cè)定酶活。酶活定義:25℃、pH4.8下每分鐘釋放出1μmol麥芽糖所需的酶量為1U。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用凱氏定氮法檢測(cè)乳清中粗蛋白含量［5］。

1.2.3 大豆乳清中蛋白質(zhì)分子量分布 采用SDSPAGE分析乳清中蛋白質(zhì)分子量分布。

1.2.4 總糖含量測(cè)定 采用蒽酮比色法［6］。

1.2.5 總固形物含量測(cè)定［7］準(zhǔn)確稱取液體樣品，在105℃烘箱中經(jīng)過(guò)24h烘干后置于干燥器中恒重12h，測(cè)定烘干后固體的質(zhì)量。

1.2.6 灰分檢測(cè)指標(biāo) 采用GB48-84進(jìn)行灰分檢測(cè)［8］。

1.2.7 跨膜壓差、膜通量及截留率的測(cè)定 在料液罐中加入純水或料液，全循環(huán)操作模式操作，設(shè)定溫度和跨膜壓差，待設(shè)備壓力表指示穩(wěn)定后，記錄膜進(jìn)口和出口的壓力，并按照式(1)計(jì)算跨膜壓差［9］:

式中:Pin為膜進(jìn)口壓力，bar;Pout為膜出口壓力，bar;ΔP 為跨膜壓差，bar。

使用量筒和秒表測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)透過(guò)液的體積，并按式(2)計(jì)算膜通量:

式中:Jv為膜通量，L/(m2·h);Vp為透過(guò)液體積，L;tf為過(guò)濾時(shí)間，h;Am為有效膜面積，m2。

定時(shí)在濃縮側(cè)和透過(guò)側(cè)取樣，檢測(cè)其中β-淀粉酶的活力，并按式(3)計(jì)算截留率:

式中:Robs為表觀截留率，%;Cp為透過(guò)液溶質(zhì)濃度，U/mL;Cb為料液主體相濃度，U/mL。

1.2.8 大豆乳清的濃縮實(shí)驗(yàn) 大豆乳清表面有大量的泡沫，廢水呈渾濁狀態(tài)，并有少量廢渣沉淀，因此料液在進(jìn)超濾膜前必須進(jìn)行預(yù)處理。將乳清廢水的pH調(diào)節(jié)在4.5～9，靜置2h后進(jìn)行離心，去除沉淀廢渣。得到的上清液用于超濾過(guò)程的原料液。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大豆乳清加入料液罐中，進(jìn)料體積為12L，在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的操作條件下進(jìn)行過(guò)濾濃縮，濃縮倍數(shù)約為10倍，每隔10min，測(cè)定膜通量，并在每個(gè)濃縮倍數(shù)下在膜兩側(cè)同時(shí)取樣，進(jìn)行成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆乳清主要成分分析

大豆乳清的主要成分如表1所示。

大豆乳清中蛋白分子量分布如圖1所示。從圖中可以看出，大豆乳清中蛋白質(zhì)的分子量主要分布在20～97ku，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［10］，譜帶 A 的分子量在92500附近，代表脂肪氧合酶;譜帶 B的分子量在55000左右，由于7S中的 β亞基分子量為52000，β-淀粉酶的分子量是57000，所以，譜帶B可能包括了這兩個(gè)成分;譜帶C的分子量在20000左右，11S蛋白中B亞基的分子量為20000，而KT胰蛋白酶抑制劑的分子量為21500，所以譜帶C中包括這兩個(gè)成分，因?yàn)槿榍逯?1S的含量少，譜帶C可以認(rèn)為主要是KT胰蛋白酶抑制劑。Sorgentini等［3］曾報(bào)道在乳清中溶解著大約占總蛋白10%左右的2S和7S成分，2S的主要成分是胰蛋白酶抑制劑，7S中含有脂肪氧合酶和β-淀粉酶。

圖1 SDS-PAGE分析大豆乳清蛋白質(zhì)分子量分布Fig.1 SDS-PAGE analyses the protein molecular weight distribution of soybean whey wastewater

對(duì)大豆乳清進(jìn)行SDS-PAGE分析是為了選擇合適截留分子量的膜，為了保證β-淀粉酶的回收率在90%以上以及避免胰蛋白酶抑制劑對(duì)膜造成的堵塞污染，選擇3ku和10ku的MWCO超濾膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)一步確定合適的膜。

2.2 料液pH對(duì)超濾的影響

大豆乳清表面有大量的泡沫，廢水呈渾濁狀態(tài)，并有少量廢渣沉淀，因此料液在進(jìn)超濾膜前必須進(jìn)行預(yù)處理。將乳清廢水的pH調(diào)節(jié)在4.5～9，靜置2h后進(jìn)行離心，去除沉淀廢渣。得到的上清液中β-淀粉酶的酶活回收率如圖2所示。從圖2可以看出，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的上清液酶活的回收率均在95%以上。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，從肉眼觀察中可以看到的現(xiàn)象是，隨著pH的增加，上清液的透明度逐漸升高，在pH7以上，溶液透明度明顯好于pH小于7的情況，這是由于pH高于7時(shí)，乳清中大部分蛋白溶解度好。

圖2 乳清廢水預(yù)處理Fig.2 Pretreatment of the soybean whey wastewater

為了考察在超濾過(guò)程中，料液不同pH對(duì)酶活回收率的影響，將上述得到的不同pH的上清液通過(guò)超濾離心管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，超濾離心的條件為:MWCO 3ku;溫度4℃;轉(zhuǎn)速3050×g;上樣量15mL;時(shí)間20min。離心結(jié)束后，分別收集濃縮液和透過(guò)液樣品，對(duì)樣品進(jìn)行酶活力的檢測(cè)，計(jì)算酶活的回收率。如圖3所示，pH4.5～5.5區(qū)間為大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)區(qū)間，因此隨著濃縮的進(jìn)行，料液逐漸變渾濁，有些蛋白吸附在膜表面，造成回收率的下降;pH6～7為酶活回收率較高的區(qū)間，pH7.0為酶活回收的最高點(diǎn)(95%);在濃縮過(guò)程中料液一直呈澄清狀態(tài)，但pH7.5～9.0時(shí)由于料液處于堿性環(huán)境下，β-淀粉酶的穩(wěn)定性有所下降，造成回收率的下降。因此，在離心超濾實(shí)驗(yàn)中，確定料液的pH為6～7。

圖3 不同pH料液對(duì)超濾過(guò)程酶活回收率的影響Fig.3 Effect of feed pH on the enzyme recovery during the UF process

為了進(jìn)一步確定超濾過(guò)程料液的pH，在實(shí)驗(yàn)?zāi)ぴO(shè)備中，選用MWCO 3ku聚醚砜材質(zhì)的超濾膜，在全循環(huán)操作模式下，比較了pH5.0、6.0、7.0下膜通量的大小。從圖4可知，在相同的跨膜壓差下，pH7.0料液的膜通量顯著高于pH6.0和pH5.0下的膜通量，pH5.0下膜通量最低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pH7.0的料液作為超濾過(guò)程的初始料液。

圖4 不同料液pH對(duì)膜通量的影響Fig.4 Effect of feed pH on the permeate flux

2.3 操作溫度對(duì)超濾的影響

將pH7.0的上清液在超濾離心管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，超濾離心的條件為:MWCO:3ku;轉(zhuǎn)速:3050×g;上樣量:15mL;時(shí)間:20min。離心結(jié)束后，分別收集濃縮液和透過(guò)液樣品，對(duì)樣品進(jìn)行酶活力測(cè)定并計(jì)算酶活回收率。有機(jī)超濾膜的耐受溫度不高于45℃，因此，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)溫度的設(shè)定范圍為4～36℃。從圖5可看出，隨著溫度的上升，酶活的膜回收率下降的趨勢(shì)較小，基本維持在90%左右。在較低的操作溫度下，酶活的膜回收率較高，但能耗較高，而且低溫下，料液粘度較大，膜通量較小。綜合考慮酶活回收率以及運(yùn)行效果，選擇(25±3)℃作為超濾過(guò)程的操作溫度。

圖5 超濾過(guò)程操作溫度對(duì)酶活回收率的影響Fig.5 Effect of operating temperature on the enzyme recovery during the UF process

2.4 跨膜壓差對(duì)初始膜通量的影響

如圖6所示，在(25±3)℃下，3ku膜的純水膜通量，隨跨膜壓差TMP的增加幾乎呈線性增加。而如圖4所示，在pH7.0料液中，3ku膜的膜通量隨著跨膜壓差的增加而增加，在跨膜壓差達(dá)到2bar以上時(shí)，膜通量上升緩慢，基本達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)的狀態(tài)，這一現(xiàn)象可由兩點(diǎn)解釋:一方面，由于膜通量的增大，使得濃差極化效應(yīng)增加，膜面濾餅層被壓縮且積累速率增大，膜污染阻力增大;另一方面，由于設(shè)備的泵額定功率是一定的，當(dāng)跨膜壓差增大時(shí)，靜壓能不斷增大，因此動(dòng)能逐漸減小，即膜面流速減小，濃差極化效應(yīng)增加［11］?？缒翰钚∮?bar時(shí)，為壓差控制區(qū)，跨膜壓差大于2bar時(shí)，則為濃差極化阻力控制區(qū)。因此，選擇跨膜壓差為2bar作為超濾濃縮過(guò)程的操作壓差。

圖6 跨膜壓差對(duì)純水膜通量的影響Fig.6 Effect of TMP on the permeate flux of distilled water

2.5 膜截留分子量的選擇

本實(shí)驗(yàn)研究了MWCO 3ku和10ku的膜對(duì)乳清進(jìn)行超濾的效果。超濾條件:跨膜壓差:2bar(3ku)，2.5bar(10ku)，操作溫度:(25±3)℃;料液 pH7.0。如圖7所示，隨著濃縮倍數(shù)的增加，兩支膜的截留率均呈上升趨勢(shì)，但是，10ku膜對(duì)β-淀粉酶的截留率明顯低于3ku膜，在同一濃縮倍數(shù)下，兩者的差距在10%以上。因此，從酶活的回收率出發(fā)考慮，優(yōu)先選擇3ku膜。同時(shí)可以從圖8中看出，3ku膜的膜通量隨著濃縮倍數(shù)的增加逐步衰減，在濃縮倍數(shù)達(dá)到10倍時(shí)，膜通量為23L/m2·h，濃縮過(guò)程平均膜通量為35L/m2·h。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇3ku膜進(jìn)行濃縮。

圖7 濃縮倍數(shù)對(duì)β-淀粉酶截留率的影響Fig.7 Effect of volumetric concentration ratio on the enzyme rejection

圖8 濃縮倍數(shù)對(duì)3ku膜通量的影響Fig.8 Effect of 3ku volumetric concentration ratio on the permeate flux

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的乳清廢水，其中β-淀粉酶的活力為11U/mL，使用MWCO 3ku的膜進(jìn)行濃縮，操作條件為:料液 pH7;跨膜壓差 2bar;操作溫度(25±3)℃，進(jìn)料體積為12L。在料液濃縮倍數(shù)為10倍時(shí)停止操作，此時(shí)的膜通量由初始的44L/(m2·h)衰減至23L/(m2·h)，平均通量達(dá)到35L/(m2·h);β-淀粉酶的酶活力可達(dá)到101U/mL，酶活濃縮倍數(shù)約為9倍，總酶活的回收率為92%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)超濾過(guò)程料液pH、操作溫度、跨膜壓差、膜截留分子量等參數(shù)的探討，得出用超濾技術(shù)對(duì)大豆乳清中β-淀粉酶進(jìn)行的濃縮的最佳條件為:料液pH為7，操作溫度(25±3)℃，跨膜壓差2bar;截留分子量MWCO 3ku的膜。得到的濃縮液中，β-淀粉酶的活力為101U/mL，濃縮倍數(shù)為10。得到的濃縮液為下一階段對(duì)β-淀粉酶進(jìn)行分離純化提供了良好的料液基礎(chǔ)。

［1］儲(chǔ)力前，付永彬.膜分離技術(shù)在大豆蛋白廢水處理中的應(yīng)用研究［J］.給水排水，2000，126(15):36-38.

［2］王秋霜，應(yīng)鐵進(jìn).大豆制品生產(chǎn)廢水綜合開發(fā)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2007，28(9):594-598.

［3］Sorgentini D A，Wagner J R.Comparative study of structural characteristics and thermal behavior of whey and isolate soybean proteins［J］.Journal of Food Biochemistry，1999，23:489-507.

［4］B·施特爾馬赫.酶的測(cè)定方法［M］.錢嘉淵，譯 .北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1992:62-65.

［5］Bourseau P，Vandanjon L，Jaouen P，et al.Fractionation of fish protein hydrolysates by ultrafiltration and nanofiltration:impact on peptidic populations［J］.Desalination，2009，244:303-320.

［6］寧正祥.食品成分分析手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

［7］趙黎明，趙鶴飛，夏文水.不銹鋼模超濾澄清甲殼素堿煮廢水的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(7):65-68.

［8］GB4800-84，谷物灰分測(cè)定法［S］.

［9］Ng T B，Liu G，Wang Z T.Antioxidative activity of natural products from plants［J］.Life Science，2000，66:709-723.

［10］陳海敏，華欲飛.大豆分離蛋白生產(chǎn)中乳清成分的分析［J］.食品研究與開發(fā)，2000，21(5):5-7.

［11］Wu H C，Chen H M，Shiau C Y.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel(Scomber Austriasicus)［J］.Food Research International，2003，36(9-10):949-957.