大孔樹脂D392對(duì)萊鮑迪苷A和甜菊苷吸附作用的研究

葉發(fā)銀，楊瑞金，華 霄，趙 偉，張文斌

(江南大學(xué)食品學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

甜菊糖苷是從菊科草本植物甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的莖、葉中提取的天然產(chǎn)物，因其高甜度、低熱值、性狀穩(wěn)定、安全無毒，在食品中的應(yīng)用日益廣泛［1］。已知的10種甜菊糖苷中，甜度約為蔗糖的250～300倍，但具有明顯的后苦味［1］;RA 甜度最高(約為蔗糖的350～450倍)、口感最接近蔗糖［2］。因此，提升甜菊糖苷品質(zhì)的關(guān)鍵在于提高產(chǎn)品中RA的含量和純度。甜菊糖苷的制備工藝一般包括提取、除雜脫色、噴霧干燥等步驟，為了進(jìn)一步降低雜質(zhì)含量或提高RA的含量，要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行精制［3］。重結(jié)晶法［4-5］和溶析結(jié)晶法［6］利用 RA 與其他組分的溶解性差異對(duì)RA進(jìn)行純化，上述工藝能耗較大，晶體生長(zhǎng)慢，耗時(shí)較長(zhǎng)，且存在有機(jī)溶劑殘留問題。高速逆流色譜法可以同時(shí)分離S(純度98.3%)和RA(純度97.6%)，該工藝對(duì)設(shè)備要求較高，溶劑系統(tǒng)優(yōu)化耗時(shí)費(fèi)力，離實(shí)際應(yīng)用仍有一定差距［7］。樹脂分離技術(shù)是基于吸附選擇性發(fā)展起來的新型分離技術(shù)，具有低能耗、過程環(huán)保、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，已用于甜菊糖苷的提取分離［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，含酮基［10］、吡啶基［11］樹脂和 D107、D108 樹脂［12］對(duì) RA 具有吸附選擇性。這種吸附選擇性是由于極性和溶解性差異使得溶質(zhì)與樹脂的親和性有所不同。有學(xué)者將數(shù)種大孔吸附樹脂按一定比例混合裝柱，用于純化RA，此法集中了不同樹脂的吸附選擇性［13-15］。本工作從各種氨基樹脂中篩選吸附選擇性較高的樹脂，考察了影響樹脂吸附選擇性的因素，并利用吸附法制取了富含RA的甜菊糖苷。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大孔樹脂 D380、D392、D301T、D301R 天津南開和成科技有限公司;大孔樹脂D301、D303、D315、HZ-9、凝膠型335樹脂 上海華震科技有限公司;D890 浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)有限公司;D201、D296、D301-G江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司;凝膠型717樹脂 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;普通甜菊糖(總苷含量＞90%，RA含量25%)、RA(純度98%)山東濟(jì)寧奧星甜菊制品有限公司;甜菊糖苷提取物(RA含量70.3%)、S(純度95%)實(shí)驗(yàn)室自制。

LaChrom Elite L-2000高效液相色譜儀 日本Hitachi公司;BS 224 S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;RW20型機(jī)械攪拌器 德國IKA公司;SHA-2A型冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司;FEP20-FiveEasy PlusTMpH計(jì) 梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂預(yù)處理 樹脂的預(yù)處理按照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。

1.2.2 RA和S的定量分析 HPLC色譜條件:色譜柱Asahipak NH2P-50 4E(4.6mm×250mm;日本Shodex公司);流動(dòng)相:乙腈-水(75/25，v/v)，流量1.0mL/min;柱溫 35℃;檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm;進(jìn)樣量10μL。S的工作曲線在0.1～5.0g/L線性良好，曲線方程 A1=1507830C1+183448(R2=0.999，n=6)，式中A1為S峰面積，C1為S質(zhì)量濃度(g/L);RA的工作曲線在0.1～7.5g/L線性良好，曲線方程 A2=1245797C2+177463(R2=0.999，n=6)，式中 A2為RA峰面積，C2為RA質(zhì)量濃度(g/L)。

1.2.3 樹脂的篩選 根據(jù)14種樹脂對(duì)RA和S的靜態(tài)吸附率、靜態(tài)解吸率和吸附殘液中RA/S比值來篩選樹脂。按文獻(xiàn)［15］測(cè)定樹脂含水量。在具塞錐形瓶中加入相當(dāng)于干基重1.00g預(yù)處理樹脂和混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液20mL，于298.15K恒溫振蕩器振蕩(150r/min)12h，將樹脂和吸附殘液過濾，樹脂用20mL乙醇-水(20/80，v/v)解吸。HPLC分析吸附殘液中RA和S含量，并把吸附殘液中RA/S(色譜圖中RA和S峰面積之比)作為衡量樹脂吸附選擇性的依據(jù)。平衡吸附量、靜態(tài)吸附率、靜態(tài)解吸率分別按式(1)～式(3)計(jì)算。

式中，qe-溶質(zhì)的平衡吸附量(mg/g);C0-吸附前溶質(zhì)濃度(g/L);Ce-吸附平衡時(shí)溶質(zhì)濃度(g/L);Vi-混合糖苷水溶液體積(L);M-樹脂含水量;W-濕樹脂質(zhì)量(g);Cd-解吸液溶質(zhì)濃度(g/L);Vd-解吸液體積(L)。

1.2.4 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 取相當(dāng)于干基重1.00g預(yù)處理樹脂，加入5g/L混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液20mL，于298.15K恒溫振蕩器(150r/min)中進(jìn)行吸附。一定時(shí)間間隔取樣100μL進(jìn)行HPLC分析，直至吸附平衡。

1.2.5 吸附等溫曲線的制作 在具塞錐形瓶中加入相當(dāng)于干基重1.00g預(yù)處理樹脂和不同初始濃度的混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液20mL，分別于298.15、318.15、328.15K 下振蕩(150r/min)6h，HPLC 分析吸附殘液組成。以RA或S的平衡濃度(Ce)為橫坐標(biāo)，單位質(zhì)量樹脂對(duì)RA或S的平衡吸附量(qe)為縱坐標(biāo)，繪制吸附等溫曲線。

1.2.6 溫度和吸附液初始濃度對(duì)吸附選擇性的影響

通過對(duì)同一場(chǎng)景進(jìn)行取景后，通過攝像機(jī)標(biāo)定獲得的內(nèi)、外參數(shù)對(duì)兩個(gè)圖像進(jìn)行矯正、獲得視差，進(jìn)而得到物體在三維空間中的坐標(biāo)以及攝像頭與物體之間的距離。在確定前方障礙物前，預(yù)先設(shè)定無人機(jī)的安全距離L以及一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的點(diǎn)數(shù)N，在計(jì)算每一個(gè)匹配點(diǎn)到攝像機(jī)的距離后，會(huì)得到n個(gè)距離大于L的匹配點(diǎn)，如果n>N,則可視為無人前方有障礙物，于是無人機(jī)可以在橫向平面的任意方向水平運(yùn)動(dòng)，直到n

取相當(dāng)于干基重1.00g預(yù)處理樹脂，加入20mL混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液(初始濃度分別為3、4、5、7.5g/L)，分別考察 298.15、318.15、328.15K 時(shí)樹脂的吸附選擇性，待吸附平衡后取樣進(jìn)行HPLC分析。1.2.7 吸附液pH對(duì)吸附選擇性的影響 取相當(dāng)于干基重1.00g預(yù)處理樹脂，加入20mL濃度為5g/L的混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液，在298.15K下考察吸附液 pH(2、3、4.4、5、5.3、6.4、7、8.7、11.6、12.7)對(duì)吸附選擇性的影響，待吸附平衡后取樣進(jìn)行HPLC分析，按式(3)計(jì)算吸附率。

1.2.8 溶劑對(duì)吸附選擇性的影響 預(yù)處理樹脂于105℃烘箱中干燥，準(zhǔn)確稱取1.00g。分別采用去離子水、乙酸乙酯-二甲亞砜(90/10，v/v)、乙腈-水(75/25和90/10，v/v)、乙醇-水(90/10，v/v)等溶劑溶解混合糖苷(RA/S=1∶1)，配制濃度為5g/L的吸附液，在298.15K下考察溶劑對(duì)吸附選擇性的影響。1.2.9 分離實(shí)驗(yàn) 稱取相當(dāng)于干基重1.00g預(yù)處理樹脂，加入20mL濃度為5g/L的甜菊糖苷水溶液(pH7.0，RA含量分別為25%和70.3%)，在298.15K下靜態(tài)吸附6h，計(jì)算靜態(tài)吸附率、吸附殘液中RA/S比值，以及RA在吸附殘液中的保留率。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂的吸附選擇性

篩選樹脂時(shí)，為了保證吸附殘液中一定的溶質(zhì)濃度，D380、D201、D296、D392 采用初始濃度為 5g/L 的吸附液，D303、D301-T、D301-G、D301-R 采用初始濃度為3.5g/L 的吸附液，D315、D301、D890、335、717、HZ-9采用初始濃度為2g/L的吸附液，結(jié)果見表1。

由表1可知，帶伯氨基 D392和帶叔氨基的D301-G吸附選擇性較好，殘液中RA/S分別為2.247和1.608。樹脂對(duì)S和RA的吸附主要依靠疏水相互作用，S的疏水性比RA的強(qiáng)，樹脂較多地吸附S，從而表現(xiàn)出吸附選擇性。樹脂極性對(duì)吸附性能有重要影響。伯氨基和叔氨基為極性基團(tuán)，改變了樹脂表面的極性，它們還與溶質(zhì)分子的羥基形成氫鍵［15］，使得吸附選擇性增加。陳天紅等［10］向非極性大孔吸附樹脂骨架引入酮基，提高了樹脂的吸附選擇性，酮基含量為0.96mmol/g時(shí)，樹脂對(duì)S和RA的吸附率分別為87.3%和81.9%，吸附殘液中RA/S為1.02(初始值為0.72)。陳天紅等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，引入吡啶基也可以提高樹脂的吸附選擇性。當(dāng)吡啶基含量為0.29mmol/g時(shí)效果最好，吸附殘液中RA/S可達(dá)0.84(初始值為0.67)。施榮富等［16］的研究表明，帶季氨基的強(qiáng)極性吸附樹脂ADS-7對(duì)RA具有一定的吸附選擇性。本研究同樣表明帶季氨基的D296、D201、D890和717樹脂對(duì)RA具有吸附選擇性(見表1)。需要說明的是，樹脂的吸附選擇性是功能基和樹脂骨架結(jié)構(gòu)共同發(fā)揮作用的結(jié)果［10-11］，如含有多種類型氨基的335、HZ-9樹脂和帶叔氨基的D301、D315對(duì)S和RA的吸附力較弱，幾乎不具有吸附選擇性。D392吸附選擇性最好，而且吸附力較強(qiáng)，解吸相對(duì)容易，使用20%乙醇就能很好地解吸，因此選擇D392作進(jìn)一步研究。

表1 樹脂的吸附選擇性Table 1 The adsorption selectivity of selected resins

2.2 吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖1可知，在吸附初始階段(0～1h)，樹脂對(duì)溶質(zhì)分子的吸附速率較快，RA和S穿過液膜到達(dá)樹脂外表面;1h后，吸附速率明顯減慢，此時(shí)樹脂表層吸附接近飽和，溶質(zhì)分子由樹脂表層向樹脂孔隙內(nèi)部擴(kuò)散，擴(kuò)散阻力不斷增加;4h后，溶質(zhì)分子主要在樹脂內(nèi)表面吸附，吸附逐漸趨于平衡。此外，D392對(duì)S的吸附能力大于對(duì)RA的吸附能力。

2.3 大孔樹脂D392吸附等溫曲線

由圖2～圖3可知，D392對(duì)S和RA的吸附量隨著溫度升高而降低，說明吸附過程為放熱過程，溫度升高不利于吸附;另一方面，溫度升高會(huì)增加S和RA在水相中的溶解性，使得被吸附的溶質(zhì)減少［10］。

對(duì)各溫度下的qe～Ce進(jìn)行線性回歸分析，可求出樹脂對(duì)S和RA的分配系數(shù):

式中，q為平衡吸附量(mg/g干基樹脂)，C為吸附平衡時(shí)溶質(zhì)濃度(g/L)，K為分配系數(shù)(L/kg)。

各溫度下樹脂對(duì)S和RA的分配系數(shù)見表2。由表2可知，在供試液濃度范圍內(nèi)，樹脂對(duì)S的分配系數(shù)顯著大于RA的分配系數(shù)。

圖1 大孔樹脂D392吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Adsorption kinetics curves on D392 macroporous resin

圖2 大孔樹脂D392對(duì)S的吸附等溫曲線Fig.2 Adsorption isotherm of S on D392 macroporous resin

圖3 大孔樹脂D392對(duì)RA的吸附等溫曲線Fig.3 Adsorption isotherm of RAon D392 macroporous resin

表2 各溫度下S和RA的分配系數(shù)K(L/kg)Table 2 Distribution coefficients，for S and RA at different temperatures

為了描述不同溫度條件下D392對(duì)S和RA的吸附選擇性，定義選擇性因數(shù)(αj/i)為S的分配系數(shù)(Kj)和RA的分配系數(shù)(Ki)之比:

由表3可知，298.15K時(shí)，D392的選擇性因數(shù)最大，隨著溫度升高，樹脂對(duì)S和RA的吸附選擇性減弱。

表3 各溫度下樹脂對(duì)S、RA的選擇性因數(shù)(αj/i)Table 3 Selectivity values(αj/i)for S and RA at different temperatures

2.4 溫度和吸附液初始濃度對(duì)吸附選擇性的影響

由圖4可知，在298.15K，混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液濃度為5g/L時(shí)，殘液中RA/S比值達(dá)到最大值，這時(shí)D392對(duì)RA和S的吸附選擇性最大;隨著溫度升高，D392對(duì)RA和S的吸附選擇性減弱。此外，由于樹脂對(duì)不同濃度溶質(zhì)的平衡吸附量不同，吸附液初始濃度對(duì)吸附選擇性有影響，當(dāng)吸附液初始濃度為5g/L時(shí)，D392對(duì)RA和S的吸附選擇性較好。

圖4 溫度和吸附液初始濃度對(duì)大孔樹脂D392吸附選擇性的影響Fig.4 Influence of temperature and concentration of adsorption solution on adsorption selectivity

2.5 pH對(duì)吸附選擇性的影響

由圖5可知，pH影響D392對(duì)S和RA的總吸附量。在酸性水溶液中，總吸附量較小。因?yàn)閜H較低時(shí)，樹脂骨架上的氨基被解離，氨基與S和RA分子上的羥基之間的氫鍵被破壞，同時(shí)銨根離子的水合提高了樹脂表面的極性，使得總吸附量較小;當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，氨基解離程度減弱，氨基同S和RA分子上的羥基之間的氫鍵作用增強(qiáng)，當(dāng)pH＞9時(shí)，氨基幾乎全部游離，除了氫鍵作用外，樹脂表面的疏水性增強(qiáng)也使其對(duì)S和RA的吸附量增加。

結(jié)果還表明，pH影響D392對(duì)S和RA的吸附選擇性。在中性條件下(pH7.0)，殘液的RA/S較大，在酸性和堿性條件下則較小。樹脂的吸附選擇性是由樹脂的微孔結(jié)構(gòu)、孔徑尺寸、表面極性以及與S、RA分子產(chǎn)生相互作用的功能基團(tuán)共同促成的［10］。RA比S多一個(gè)葡萄糖基，使得RA的極性大于S的極性。在酸性水溶液中，由于氨基被解離，氫鍵作用受到抑制，在堿性水溶液中，樹脂表面的疏水性增強(qiáng)，這都減弱了樹脂的吸附選擇性。

圖5 pH對(duì)大孔樹脂D392吸附選擇性的影響Fig.5 Influence of pH value of adsorption solution on adsorption selectivity

2.6 溶劑對(duì)吸附選擇性的影響

由圖6可知，溶劑對(duì)D392吸附選擇性的影響顯著。在水相中，殘液RA/S＞1，樹脂對(duì)S的吸附能力大于對(duì)RA的吸附能力。在乙醇-水(90/10，v/v)中，吸附選擇性明顯減弱，因?yàn)橐掖冀档土巳軇O性，溶質(zhì)與樹脂的疏水作用和氫鍵作用均被抑制［17］。在乙腈-水(75/25，v/v)中，吸附選擇性變得不明顯，乙腈降低了溶質(zhì)分子疏水區(qū)與樹脂表面的疏水作用，對(duì)水分子的排斥減弱，進(jìn)而水分子破壞了氨基與溶質(zhì)的氫鍵作用。在乙腈-水(90/10，v/v)中，樹脂對(duì)S的吸附量小于對(duì)RA的吸附量，這是由于乙腈使溶劑極性顯著降低，導(dǎo)致極性相對(duì)較強(qiáng)的RA更多地分配在固定相中。以乙酸乙酯-二甲亞砜(90/10，v/v)為溶劑，由于二甲亞砜能與溶質(zhì)分子的羥基形成氫鍵，同時(shí)二甲亞砜的負(fù)電性與樹脂氨基的正電性的靜電吸引作用，使得溶質(zhì)分子的羥基與樹脂氨基的氫鍵遭到破壞，因而吸附選擇性微弱。以上結(jié)果表明，D392的吸附選擇性是疏水吸附和氫鍵吸附協(xié)同作用的結(jié)果。

圖6 溶劑對(duì)大孔樹脂D392吸附選擇性的影響Fig.6 Influence of solvents on adsorption selectivity

2.7 大孔樹脂D392對(duì)RA的富集

將RA含量分別為25%和70.3%的兩種實(shí)際樣品配制成濃度為5g/L的供試液(pH7.0)，采用D392在298.15K靜態(tài)吸附6h。RA含量為25%的樣品(RA/S=0.41)，經(jīng)選擇性吸附，吸附殘液中RA含量提高到40%;RA含量為70.3%的樣品(RA/S=3.97)，經(jīng)D392吸附，吸附殘液的RA/S=8.58，RA含量提高到88.4%，RA保留率為68.0%。胡靜等［12］以含72%RA的糖液(初始RA/S=4.09)為供試液發(fā)現(xiàn)大孔樹脂D107和D108能較多地吸附S，使得流出液中RA含量增加。本工作的研究結(jié)果表明，對(duì)于低RA含量的產(chǎn)品，經(jīng)D392吸附可起到富集RA的效果，對(duì)于高RA含量的產(chǎn)品，則可對(duì)RA進(jìn)行純化。

3 結(jié)論

大孔樹脂D392在水溶液中對(duì)RA和S具有較好的吸附選擇性，在乙酸乙酯-二甲亞砜(90/10，v/v)、乙醇-水(90/10，v/v)、乙腈-水(75/25，v/v)等溶劑中，吸附選擇性變得不明顯。同時(shí)，D392具有良好的解吸性能，使用20%乙醇就能很好地解吸。在水溶液中，D392對(duì)S和RA的吸附為放熱過程，且隨溫度升高吸附選擇性降低。供試液pH和濃度對(duì)吸附選擇性有影響，含 RA70.3%的實(shí)際樣品(pH7.0、5g/L)經(jīng)D392吸附處理，吸附殘液中RA含量可提高到88.4%，RA保留率為68.0%。

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