乳山灣外海溶氧低值區(qū)細(xì)菌多樣性初步研究＊

崔志松，王紹良，臧家業(yè)，冉祥濱

（國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

乳山灣外海溶氧低值區(qū)細(xì)菌多樣性初步研究＊

崔志松，王紹良，臧家業(yè)＊，冉祥濱

（國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

采用化學(xué)裂解法從乳山灣外海溶氧低值區(qū)不同溶解氧質(zhì)量濃度（3.7～7.0mg·L－1）的6個(gè)站位海水樣品中提取了環(huán)境DNA樣品。以試劑盒純化后的DNA樣品為模板擴(kuò)增其16SrRNA基因V3區(qū)，通過變性梯度凝膠電泳、分子文庫(kù)構(gòu)建及DNA測(cè)序?qū)θ苎醯椭祬^(qū)海水中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，乳山灣外海溶氧低值區(qū)不同溶解氧質(zhì)量濃度的6個(gè)站位底層海水樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是相似的，它們均由隸屬于Alteromonas（交替單胞菌屬）、Salegentibacter（需鹽桿菌屬）等10個(gè)屬的18種細(xì)菌組成。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌分別屬于α變形菌綱（2種）、γ變形菌綱（12種）和黃桿菌綱（3種）三個(gè)大類。在乳山灣外海溶氧低值區(qū)的海水樣品中細(xì)菌多樣性最高的類群是γ變形菌綱。

溶氧低值區(qū)；生物多樣性；乳山灣；變性梯度凝膠電泳

海水中溶解氧質(zhì)量濃度的變化受物理、化學(xué)和生物等多種過程的影響，所以它成為反映水體水質(zhì)和生物生長(zhǎng)狀況的重要參數(shù)。河口和近海水域營(yíng)養(yǎng)鹽及其它有機(jī)污染物的總量劇增［1］極大地促進(jìn)了相關(guān)海域的初級(jí)生產(chǎn)力，也造成了其底層的溶氧水平較低甚至缺氧現(xiàn)象，形成底層溶氧低值區(qū)（3.7～7.0mg·L－1）或低氧區(qū)（≤2.0mg·L－1）［2］。溶氧低值區(qū)和低氧區(qū)的產(chǎn)生、存在可能對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、底棲生物的分布及生物多樣性等產(chǎn)生重要影響。同時(shí)，底棲生物、底沉積物中的微生物種類和分布也極大地影響著底部水體溶解氧的分布。

海洋溶氧低值現(xiàn)象已越來(lái)越引起海洋學(xué)家的關(guān)注，河口、海灣等水體都存在溶氧低值區(qū)［2－5］。其中，關(guān)于河口區(qū)域溶氧低值現(xiàn)象的研究最為深入［2，6－7］，而對(duì)近岸海域底層溶氧低值現(xiàn)象及其成因一直未進(jìn)行深入的研究。關(guān)于近海溶氧低值現(xiàn)象對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響的研究也很少；反之，涉及微生物在溶氧低值區(qū)或低氧區(qū)形成過程中所起到作用的研究也少有報(bào)道。微生物可以加速有機(jī)物的分解，而這一過程消耗水體中的氧氣，這在一定程度上造成了近岸水體底層氧的虧損。對(duì)近海溶氧低值區(qū)中微生物群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種的分析有利于加深對(duì)溶氧低值水域生物地球化學(xué)過程的認(rèn)識(shí)，并且能夠?yàn)榈脱鯀^(qū)形成的原因提供一些可參考的依據(jù)?，F(xiàn)以乳山灣外海溶氧低值區(qū)（3.7～7.0mg·L－1）為研究對(duì)象，結(jié)合不依賴培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)、序列分析技術(shù)對(duì)乳山灣外海溶氧低值區(qū)的細(xì)菌多樣性進(jìn)行初步研究，以期為闡明溶氧低值環(huán)境壓力與微生物種群結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)種之間的關(guān)系提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 站位的選擇及底層海水化學(xué)參數(shù)

根據(jù)2009－09乳山灣外海不同站位表層、10m、底層三個(gè)層次海水樣品各項(xiàng)化學(xué)參數(shù)的調(diào)查結(jié)果，選取了B7，C3，C6，E7，F(xiàn)3，F(xiàn)7共6個(gè)站位的底層海水樣品進(jìn)行微生物多樣性研究（圖1和表1）。6個(gè)站位底層海水溶解氧由高到低依次是站位C3（7.0mg·L－1），B7（6.7mg·L－1），F(xiàn)7（6.5mg·L－1），F(xiàn)3（5.9mg·L－1），E3（5.6mg·L－1）和C6（3.7mg·L－1）。由調(diào)查結(jié)果可見，不同站位之間溶解氧水平的差異顯著，且均明顯低于其水體溶解氧的理論飽和質(zhì)量濃度，而6個(gè)站位底層海水的溫度、鹽度區(qū)域性差異明顯小于溶解氧差異，其變化幅度也較小。這表明調(diào)查區(qū)域存在一定程度上的耗氧過程。

與溫度、鹽度變化規(guī)律不同的是，在溶解氧較低的C6，E3和F3站位底層海水樣品中硝酸鹽和磷酸鹽的質(zhì)量濃度也明顯高于其它3個(gè)站位（表1）。這表明水體耗氧過程從一定程度上影響了營(yíng)養(yǎng)鹽的質(zhì)量濃度及分布，并可能影響微生物種類及相對(duì)豐度。從目前的分析來(lái)看，乳山灣外近岸低氧區(qū)的面積較小，其成因主要是由于水體和底泥耗氧所致；人類活動(dòng)（污水排放、人工養(yǎng)殖）的增多導(dǎo)致大量的有機(jī)質(zhì)排入近海，并為耗氧過程提供了物質(zhì)基礎(chǔ)［8］。

圖1 乳山灣外海溶氧低值區(qū)調(diào)查站位圖Fig.1 Sampling stations at the contiguous area with low value of dissolved oxygen of the Rushan Bay

表1 各站位海水樣品化學(xué)參數(shù)Table 1 Chemical parameters of the sea water samples at different stations

1.2 采用化學(xué)裂解法提取環(huán)境DNA

采用化學(xué)裂解法從海水樣品中提取環(huán)境總DNA，具體步驟為將500mL海水用0.22μm微孔濾膜過濾以收集細(xì)菌細(xì)胞，將濾膜轉(zhuǎn)移到50mL離心管。加入10mL DNA提取液，74μL蛋白酶K，渦旋振蕩使其充分混勻，37℃水浴30min。加入1 100μL 20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）SDS，65℃水浴2h，每隔15～20min混勻一次。7 000r／min離心10min，將上清移入新的離心管。加入等體積的氯仿／異戊醇，10 000r／min離心10min，將上清移入新的離心管。加入0.6倍體積異丙醇室溫沉淀1h，15 000r／min離心20min，棄上清。加入1mL 70%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）洗滌DNA沉淀，15 000r／min離心10min。棄上清，待乙醇揮發(fā)后加入200 μL無(wú)菌水溶解DNA。

1.3 采用試劑盒純化環(huán)境DNA樣品的純化

采用化學(xué)裂解法提取到的環(huán)境DNA樣品中含有抑制Taq酶活性的雜質(zhì)，不利于后續(xù)的分子生物學(xué)操作，所以需要采用Promega公司的Wizard DNA Clean－Up System純化試劑盒對(duì)環(huán)境DNA樣品進(jìn)行純化。

1.4 16SrRNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增

以純化后的環(huán)境DNA樣品為模板，采用引物V3F，V3R對(duì)細(xì)菌16SrRNA序列的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在反應(yīng)體系中加入引物 V3F（10μmol／L）1μL，引物 V3R（10μmol／L）1μL，dNTP（各2.5mmol／L）4 μL，10XPCR Buffer 5μL，rTaq 1U，模板DNA約50ng，最后用滅菌蒸餾水補(bǔ)至50μL。引物序列及采用的PCR熱循環(huán)程序參照文獻(xiàn)［9］。

1.5 變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，簡(jiǎn)稱DGGE）

DGGE膠中聚丙烯酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，變性劑范圍為30%～60%。將電泳緩沖液預(yù)熱至60℃，然后加樣。每個(gè)環(huán)境DNA樣品平行做3管共150μL；上樣前需要將PCR產(chǎn)物用無(wú)水乙醇沉淀并濃縮到15 μL，然后與Loading Buffer混勻后上樣。電泳程序：30V，15min；130V，4.5h。

1.6 環(huán)境16SrRNA分子文庫(kù)的構(gòu)建

以純化后的環(huán)境DNA樣品為模板采用通用引物16SF，16SR［9］對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在反應(yīng)體系中加入引物16SF（10μmol／L）1μL，引物16SR（10μmol／L）1μL，dNTP（各2.5mmol／L）4μL，10XPCR Buffer 5μL，rTaq 1U，模板DNA約50ng，最后用滅菌蒸餾水補(bǔ)至50μL。采用的PCR程序：95℃4min；94℃45s，55℃1min，72℃1.5min，循環(huán)30～32次；72℃15min，4℃保持。

采用廣州東盛PCR產(chǎn)物／DNA片段純化試劑盒對(duì)16SrRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用Takara pMD18－T連接試劑盒將純化后的PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18－T。在反應(yīng)體系中加入pMD18－T（50 ng·μL－1）1μL，SolutionⅠ（含T4DNA連接酶）5μL，PCR純化片段約300ng，最后用滅菌蒸餾水補(bǔ)至10 μL。輕柔混勻，16℃溫浴8h。按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南中的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichiacoli（E.coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α，獲得含有環(huán)境樣品16SrRNA基因的分子文庫(kù)。

1.7 分子文庫(kù)的篩選、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用菌落PCR的方法對(duì)其中含有插入片段的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行篩選、劃線分離。以直接熱裂解陽(yáng)性克隆子得到的DNA及純化后環(huán)境DNA樣品為模板，擴(kuò)增其16SrRNA V3區(qū)片段，隨后進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，根據(jù)其DGGE圖譜確定與環(huán)境DNA樣品的各條帶相對(duì)應(yīng)的克隆子條帶。挑取含有目標(biāo)16SrRNA片段的克隆子，由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交到NCBI網(wǎng)站，采用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)分析。再將目標(biāo)序列與模式株或參考菌株序列導(dǎo)入DNAMAN軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 從海水樣品中提取環(huán)境DNA

采用化學(xué)裂解法從來(lái)自6個(gè)站位B7，C3，C6，E3，F(xiàn)3，F(xiàn)7（表層、10m、底層三個(gè)層次）的18個(gè)海水樣品中均能提取到環(huán)境DNA。

2.2 環(huán)境DNA樣品的純化

環(huán)境DNA樣品經(jīng)試劑盒純化后，條帶亮度會(huì)略有降低，說(shuō)明DNA在純化過程中有一定的損失，但可以去除環(huán)境DNA樣品中抑制Taq酶活性的雜質(zhì)，便于后續(xù)的分子生物學(xué)操作。

2.3 16SrRNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

雖然以C3－表、C3－底、C6－表、C6－10m等少數(shù)幾個(gè)未經(jīng)純化的環(huán)境DNA樣品為模板能夠直接擴(kuò)增到16SrRNA V3區(qū)200bp左右的目的條帶，但大多數(shù)環(huán)境DNA樣品由于含有抑制Taq酶活性的雜質(zhì)，未能擴(kuò)增到目的條帶。這表明在對(duì)環(huán)境DNA樣品進(jìn)行分子生物學(xué)操作前，有必要先進(jìn)行純化處理。而以純化后的環(huán)境DNA樣品為模板都可以擴(kuò)增得到目的條帶，這說(shuō)明經(jīng)過純化處理后的環(huán)境DNA樣品可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）結(jié)果

通常DGGE譜圖中的每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)海水樣品細(xì)菌群落中的某種細(xì)菌，并且其信號(hào)強(qiáng)弱在一定程度上反映菌群中該細(xì)菌的相對(duì)豐度。在圖2a中泳道1～12依次為C3表，C3－10m，C3底，F(xiàn)3表，F(xiàn)3－10m，F(xiàn)3底，E3表，E3－10m，E3底，C6表，C6－10m，C6底；在圖2b中泳道1～6依次為B7表，B7－10m，B7底，F(xiàn)7表，F(xiàn)7－10m，F(xiàn)7底。盡管隨著站位不同、海水層次不同以及溶解氧水平不同，上述18個(gè)海水樣品的DGGE譜圖存在一定的差異，即條帶的多寡及亮度不同，但是其總體上反映的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是相似的（圖2），即它們是由最多18個(gè)代表不同菌種的條帶組成的（圖2）。值得注意的是，在所有海水樣品中條帶9，10與其余條帶相比其信號(hào)較強(qiáng)且相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明在此溶氧條件范圍內(nèi)它們所代表的細(xì)菌相對(duì)豐度較高。

2.5 16SrRNA分子文庫(kù)的構(gòu)建與篩選

根據(jù)DGGE圖譜條帶分析結(jié)果（圖2），選取條帶豐富、具有代表性的C3－10m和C6－10m兩個(gè)樣品擴(kuò)增環(huán)境16SrRNA基因，并構(gòu)建分子文庫(kù)。采用菌落PCR從C3－10m分子文庫(kù)中55個(gè)單菌落中篩選出21個(gè)陽(yáng)性克隆子；從C6－10m分子文庫(kù)中56個(gè)單菌落中篩選出29個(gè)陽(yáng)性克隆子。以直接熱裂解陽(yáng)性克隆子得到的DNA及純化后環(huán)境DNA樣品C3－10m和C6－10m為模板，分別擴(kuò)增其16SrRNA V3區(qū)片段，隨后以DGGE圖譜條帶分析的方法確定與環(huán)境DNA樣品的各條帶相對(duì)應(yīng)的克隆子條帶。在圖3和圖4中，泳道上的數(shù)字表示分子文庫(kù)中陽(yáng)性克隆子的編號(hào)，C3－10m或C6－10m表示以這2個(gè)環(huán)境DNA樣品為模板擴(kuò)增到的DGGE－PCR產(chǎn)物。在代表乳山灣外海溶氧低值區(qū)海水樣品中細(xì)菌群落的18個(gè)條帶中，除1個(gè)條帶未在分子文庫(kù)中獲得對(duì)應(yīng)克隆子外，其余17個(gè)條帶都能夠在文庫(kù)中獲得對(duì)應(yīng)克隆子。

圖4 C6－10m分子文庫(kù)篩選結(jié)果Fig.4 Screening of the molecular library C6－10m

通過測(cè)序、BLAST比對(duì)分析，可知由DGGE圖譜條帶所代表的海水樣品中的細(xì)菌種類（表2、圖3和圖4），這些細(xì)菌隸屬于至少10個(gè)屬。在Genbank中，條帶1與海洋細(xì)菌SCRIPPS＿413（AF359548）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度達(dá)到98.66%。菌株SCRIPPS＿413可能參與某些甲藻累積麻痹性貝毒的生物過程［10］。條帶3與一株從東太平洋深海沉積物中分離到的、能夠降解多種烷烴的模式種柴油食烷菌（Alcanivorax dieselolei NO1A；AY683531）的親緣關(guān)系最近，但兩者的相似度僅為92.05%［11］。條帶4、條帶10分別與中國(guó)南海分離到的產(chǎn)色素異養(yǎng)細(xì)菌冷蛇菌屬細(xì)菌 TW－JL－49（Psychroserpens sp.TW－JL－49；DQ073103）、需鹽桿菌屬細(xì)菌TW－JL－20（Salegentibacter sp.TW－JL－20；DQ073102）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度分別為99.12%，93.88%。這類產(chǎn)色素異養(yǎng)細(xì)菌主要存在于海洋透光層，在表層海水中的豐度最高，它們可占到可培養(yǎng)細(xì)菌的39.6%，或占細(xì)菌總數(shù)的1.4%［12］。條帶5與從韓國(guó)黃海潮灘分離到的Kangiella koreensis DSM 16069（NR＿027574）親緣關(guān)系最近，但兩者的相似度僅為84.53%［13］。Genbank中與條帶6，11，13親緣關(guān)系最近的菌株均屬于假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。其中條帶6與從北冰洋沉積物中分離到的Pseudoalteromonas sp.BSs20007（EU365511）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度達(dá)到97.80%。條帶11與1 855m深海沉積物中分離到的一株嗜冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913（AY305857）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度達(dá)到98.67%［14］。條帶13與太平洋深海多金屬結(jié)核區(qū)分離到的Pseudoalteromonas sp.ws17（AJ704790）親緣關(guān)系最近，但兩者的相似度僅為90.56%［15］。條帶7，9，16與交替單胞菌屬（Alteromonas）的3株細(xì)菌親緣關(guān)系最近，它們之間的相似度為95.21%～100%。據(jù)報(bào)道，這個(gè)屬的可培養(yǎng)細(xì)菌構(gòu)成了南海沉積物中蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌的一個(gè)最大類群（34.6%）［16］。Genbank中與條帶8，15，17親緣關(guān)系最近的菌株均屬于弧菌屬（Vibrio）。條帶8和條帶17分別與兼性厭氧細(xì)菌Vibrio hepatarius LMG 20362（NR＿025491）、富通弧菌CAIM 629（Vibrio fortis CAIM 629；NR＿025575）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度分別為98.57%，99.20%。菌株CAIM 629可發(fā)酵葡萄糖和甘露醇，而菌株LMG 20362除上述兩種碳源外還可以發(fā)酵蔗糖、苦杏素［17］。條帶15與病害瀕死牡蠣（Crassostrea gigas）血淋巴中分離到的需鈉弧菌01／252（Vibrio natriegens 01／252；AJ874353）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度達(dá)到98.15%。注射實(shí)驗(yàn)證明菌株01／252是無(wú)毒的，而弧菌屬的其它2個(gè)種（V.aestuarianus和V.splendidus）則會(huì)導(dǎo)致牡蠣死亡［18］。條帶12與從美國(guó)伍茲霍爾鹽沼表層沉積物中分離到的一株耐鹽、Fe（Ⅲ）還原細(xì)菌海藻希瓦氏菌（Shewanella algae；X81622）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度達(dá)到99.27%［19］。條帶14與遍在遠(yuǎn)洋桿菌HTCC1062（Pelagi－bacter ubique HTCC1062；AF510191）親緣關(guān)系最近，兩者的相似度達(dá)到98.80%。菌株HTCC1062所代表的α－變形菌綱SAR11類群，是一類體積微?。?.01μm3）、難以培養(yǎng)的細(xì)菌，可占到大洋浮游細(xì)菌種群的26%［20］。條帶18與1株好氧海洋細(xì)菌Jannaschiasp.CCS1（CP000264）親緣關(guān)系最近，但兩者的相似度僅為86.85%。菌株CCS1是一類基于細(xì)菌葉綠素α的光能自養(yǎng)菌的典型代表［21］。

表2 海水樣品C3－10m和C6－10m中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Table 2 Analysis of the structure of bacterial community harboring in sea water sample C3－10mand C6－10m

通過DNAMAN軟件分析，構(gòu)建了基于16SrRNA基因序列相似度的乳山灣外海低氧區(qū)海水中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。乳山灣外海低氧區(qū)細(xì)菌分別屬于α變形菌綱（12種）、γ變形菌綱（2種）、黃桿菌綱（3種）三個(gè)大類。綜上，在乳山灣外海溶氧低值區(qū)的海水樣品中細(xì)菌多樣性最高的類群是γ變形菌綱。

圖5 乳山灣外海溶氧低值區(qū)海水樣品中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of the bacteria harboring in the sea water samples of the contiguous area with low value of dissolved oxygen of the Rushan Bay

3 討 論

由于海洋微生物中的絕大多數(shù)是未培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的，從沉積物、海水等海洋環(huán)境樣品中直接提取總DNA然后進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)分析及核苷酸序列測(cè)定越來(lái)越受到海洋學(xué)家的重視。李友訓(xùn)等報(bào)道了一種改進(jìn)后的化學(xué)裂解和酶消化相結(jié)合的海洋沉積物總DNA提取、純化方法，并對(duì)東太平洋深海沉積物中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步分析［22］。我們采用濾膜抽濾、化學(xué)裂解、酶消化的方法成功地從乳山灣外海溶氧低值區(qū)多個(gè)站位的海水樣品中提取到環(huán)境DNA，其中部分DNA的純度較高，甚至可以不經(jīng)過純化而直接用于PCR操作。經(jīng)過Promega試劑盒純化后的所有環(huán)境DNA均可達(dá)到進(jìn)行擴(kuò)增、構(gòu)建分子文庫(kù)等分子生物學(xué)操作的要求。這種優(yōu)化后的海水樣品DNA提取方法耗時(shí)短、產(chǎn)率大、純度高，能夠?yàn)楹Ｑ笪⑸锏亩鄻有匝芯吭诜椒▽W(xué)上提供一定的支持和參考。

采用DGGE技術(shù)研究環(huán)境微生物的多樣性通常有2種方法。1）對(duì)環(huán)境樣品的DGGE條帶直接切膠回收再測(cè)序。2）先從環(huán)境DNA中擴(kuò)增16SrRNA基因全序列、構(gòu)建分子文庫(kù)，然后再進(jìn)行DGGE分析和測(cè)序。本研究采用了第2種方法，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以獲得16SrRNA基因全長(zhǎng)片段，其比對(duì)結(jié)果可信度高；缺點(diǎn)在于環(huán)境樣品的生物多樣性將被低估。在代表乳山灣外海溶氧低值區(qū)海水樣品中細(xì)菌群落的18個(gè)條帶中，17個(gè)條帶在文庫(kù)中獲得對(duì)應(yīng)的克隆子，這表明該文庫(kù)具有較高的呈現(xiàn)率。實(shí)際上，DGGE圖譜中的有些條帶往往代表一種以上微生物（其16SrRNA基因V3區(qū)解鏈溫度一致）。我們?cè)谖膸?kù)中也挑取了與同一條帶相對(duì)應(yīng)的多個(gè)克隆子進(jìn)行了測(cè)序、比對(duì)，但是并未測(cè)得不同的序列，即它們所含有的基因序列是一致的（例如，與條帶10對(duì)應(yīng)的4個(gè)克隆：克隆19、克隆97、克隆98、克隆99）。所以，在后續(xù)工作中需要提高文庫(kù)的容量來(lái)達(dá)到更好呈現(xiàn)實(shí)際生物多樣性的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

我們的研究發(fā)現(xiàn)，盡管所選乳山灣外海底層溶氧低值區(qū)不同站位之間存在較明顯的溶解氧差異，但是它們之間的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異并不顯著。這說(shuō)明乳山灣外海海水中的細(xì)菌群落對(duì)溶氧低值環(huán)境壓力的適應(yīng)能力較強(qiáng)。目前，關(guān)于溶氧低值海洋環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道不多。其中，劉敏等應(yīng)用PCR－DGGE技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江口低氧區(qū)細(xì)菌群落進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)江口低氧水體中的細(xì)菌群落組成與非低氧水體的是不同的，在低氧區(qū)水體中的優(yōu)勢(shì)菌種是屬于擬桿菌門（Bacteroides）黃桿菌綱（Flavobacteria）的細(xì)菌［23］。對(duì)乳山灣外海溶氧低值區(qū)不同溶解氧水平（3.7～7.0mg·L－1）的6個(gè)站位底層海水樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和比較，并發(fā)現(xiàn)由條帶9和條帶10代表的2種優(yōu)勢(shì)菌種之一也是屬于上述黃桿菌綱的細(xì)菌（Salegentibacter sp.TW－JL－20，93.88%）。但是，還需要進(jìn)一步研究這些黃桿菌綱細(xì)菌的生理生態(tài)功能，以闡釋溶氧低值區(qū)形成與微生物活動(dòng)之間的關(guān)系。季倩等也對(duì)長(zhǎng)江口外缺氧區(qū)進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)在低氧區(qū)形成前后，微微型浮游生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，聚球藻和病毒的豐度明顯增加，而微微型真核浮游植物的豐度則急劇下降，但異養(yǎng)細(xì)菌豐度的變化不明顯［24］。在本研究中，乳山灣外海溶氧低值區(qū)不同溶解氧水平的6個(gè)站位底層海水樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也是相似的，它們均由隸屬于10個(gè)屬的18種細(xì)菌組成，其中細(xì)菌多樣性最高的類群是γ變形菌綱的細(xì)菌。從我們的比對(duì)結(jié)果來(lái)看，這些細(xì)菌大多數(shù)屬于化能異養(yǎng)細(xì)菌和光能異養(yǎng)細(xì)菌，并且其近緣細(xì)菌的總豐度在自然菌群中所占比例較高（條帶4、條帶10、條帶14），它們能夠在有機(jī)物分解過程中消耗氧氣，這些細(xì)菌在合適條件下的大量增殖可能是導(dǎo)致形成溶氧低值區(qū)的因素之一。目前，乳山灣外海低氧區(qū)面積較小，且其它環(huán)境參數(shù)差異不大（表1），這也可能是導(dǎo)致調(diào)查區(qū)域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)大致相似的重要原因。對(duì)溶氧低值區(qū)微生物種群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)菌種的解析可以為后續(xù)的微生物分離培養(yǎng)、溶氧低值或缺氧現(xiàn)象的生物化學(xué)成因分析提供一定的參考。

致謝：中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院楊官品教授對(duì)本文的細(xì)致修改。

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（高 峻 編輯）

Bacterial Diversity in an Offshore Low Dissolved Oxygen Content Area Contiguous to Rushan Bay

CUI Zhi－song，WANG Shao－liang，ZANG Jia－ye，RAN Xiang－bin
（The First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China）

Environmental DNA was extracted from sea waters collected at 6sampling stations with different dissolved oxygen level located at an offshore low dissolved oxygen content（3.7～7.0mg·L－1）area contiguous to Rushan Bay with a chemical lysis method.The bacterial community structures of these stations were determined according to the V3region of bacterial 16SrRNA genes amplified with purified environmental DNA as templates and analyzed with combination of denaturing gradient gel electrophoresis，library construction and sequencing.Results showed that the bacterial communities were similar in structure with each other，although the dissolved oxygen contents at the bottom layers of these stations were different.In total，18bacterial species were identified belonging to 10genera ofα－Proteobacteria，γ－Proteobacteria and Flavobacter as were determined with phylogenetic analysis.Species ofγ－proteobacteria were the most diverse in this area.

low dissolved oxygen content area；biodiversity；Rushan Bay；denaturing gradient gel electrophoresis

January 24，2011

Q939

A

1671－6647（2012）03－0369－11

2011－01－24

中國(guó)近海海洋綜合調(diào)查與評(píng)價(jià)專項(xiàng)課題——浮山灣外海低氧區(qū)調(diào)查與研究（908－01－BC14）；國(guó)家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金——海洋專性解烴菌Cycloclasticus spp.的代謝特性及協(xié)同降解高分子量多環(huán)芳烴的研究（2010G23）

崔志松（1981－），男，山東青島人，碩士，助理研究員，主要從事環(huán)境微生物學(xué)方面研究.E－mail：czs@fio.org.cn

＊通訊作者