巖藻多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響

石磊，高欣，趙艷威，謝文利，*

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，天津 300162；2.武警后勤學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津 300162）

巖藻多糖（Fucoida）又稱褐藻糖膠、巖藻多糖硫酸酯，是存在于所有褐藻中的一種水溶性雜多糖[1]。研究表明，巖藻多糖具有廣泛的生理生化活性，既有抗病毒、抗凝血和抗血栓作用，還具有抗腫瘤、抗輻射、抗疲勞、抗氧化、降血脂等多種功效。巖藻多糖抑制腫瘤的效果，不是直接作用于腫瘤細(xì)胞，而是通過(guò)提高生物機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的防御能力來(lái)實(shí)現(xiàn)的[2]。本文將對(duì)巖藻多糖是否具有提高宿主免疫系統(tǒng)功能進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明其抗腫瘤作用的機(jī)制，為開發(fā)巖藻多糖的藥用價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥品試劑

巖藻多糖：武警后勤學(xué)院生藥學(xué)教研室提供；PBS，Hank′s Saline，阿氏液，瑞氏液，姬姆薩染色液，RPMI1640：購(gòu)自GIBCO/BRL公司；刀豆蛋白A（ConA），MTT：購(gòu)自Sigma公司。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí) C57BL/6 小鼠，16 g～18 g，雌雄兼用，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2002－0003。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

model－680酶標(biāo)儀：Bio－RAD 公司；LDZ0.8離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；AT250電子天平：瑞士METTLER公司；Revco超凈工作臺(tái)：estinghouse公司；OLIMPUS IX50倒置顯微鏡：OLIMPUS公司。

1.4 分組與給藥

取C57BL/6小鼠80只，隨機(jī)分為4組，每組20只，巖藻多糖低劑量組（0.1 g/kg）、巖藻多糖中劑量組（0.2 g/kg）、巖藻多糖高劑量組（0.5 g/kg）、對(duì)照組（給予等體積生理鹽水）。各組動(dòng)物每天定時(shí)灌胃（ig）給予相應(yīng)藥物，連續(xù)20 d。

1.5 巖藻多糖對(duì)小鼠廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)、臟器／體重比值的影響

連續(xù)給藥20 d后，各組小鼠眼眶后靜脈叢注射印度墨汁 0.1 mL，注射印度墨汁后 2 min（t1）、10 min（t2）分別從內(nèi)眥靜脈叢取血 20 μL加到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，在650 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度，記錄OD值，計(jì)算吞噬指數(shù)。取出肝臟、脾臟及胸腺稱重，計(jì)算臟器／體重比值。

吞噬指數(shù)α=[體重/（肝重+脾重）]×k－3

（k=lgOD1－lgOD2/（t2－t1））

1.6 巖藻多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

采用微量溶血分光光度法和溶血空斑試驗(yàn)法[3]，小鼠連續(xù)灌胃20 d后，各組小鼠腹腔注射10%SRBC的細(xì)胞懸液0.2 mL進(jìn)行免疫。5 d后，取小鼠血及脾臟分別做HC50的測(cè)定和抗體生成細(xì)胞檢測(cè)。

1.7 巖藻多糖對(duì)小鼠腹腔單核－巨噬細(xì)胞功能的影響

小鼠連續(xù)灌胃20 d后，各組小鼠腹腔注射2%雞紅細(xì)胞懸液1 mL。30 min后，取腹腔洗液于37℃孵箱溫育30 min。孵育結(jié)束，吉姆薩染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞。

1.8 巖藻多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

按文獻(xiàn)[4]方法，取滅菌的平皿，加入5 mL Hank′s液。頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，制成2.5×106/mL的脾細(xì)胞懸液。將上述細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，每孔 60 μL、ConA（10 μg/mL）40 μL、以及不同濃度的巖藻多糖0.1 mL，使每孔的巖藻多糖濃度分別為2、5、10 μg/mL，各組做4復(fù)孔。將培養(yǎng)板放入含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h～72 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h～6 h，于培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入1 mg/mL MTT液，10 μL/孔。37℃培養(yǎng)6 h。各孔內(nèi)加入0.01 mol/L鹽酸－異丙醇110 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm。根據(jù)OD值的大小計(jì)算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。

2 結(jié)果

2.1 巖藻多糖對(duì)小鼠廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)、臟器／體重比值的影響

各組小鼠連續(xù)給予巖藻多糖20 d后，高、中劑量巖藻多糖組能顯著提高小鼠脾臟／體重比值和胸腺／體重比值，與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；高劑量巖藻多糖組吞噬指數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 巖藻多糖對(duì)小鼠廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)臟器/體重比值的影響（n=10，±s）Table 1 Effect of Fucoida to thymus/body weight ratio in mice

表1 巖藻多糖對(duì)小鼠廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)臟器/體重比值的影響（n=10，±s）Table 1 Effect of Fucoida to thymus/body weight ratio in mice

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 脾臟／體重比值/（mg/g）胸腺／體重比值/（mg/g） 吞噬指數(shù)對(duì)照組 3.15±0.21 1.53±0.21 3.76±0.29低劑量巖藻多糖組 3.46±0.18 1.69±0.17 4.37±0.83中劑量巖藻多糖組 4.07±0.33* 1.91±0.32* 5.16±0.72高劑量巖藻多糖組 4.28±0.19* 2.11±0.19* 5.53±0.63*

由表1可知，巖藻多糖能提高免疫器官功能，提高免疫器官的吞噬能力。

2.2 巖藻多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

小鼠連續(xù)灌胃20 d后，經(jīng)HC50測(cè)定和抗體生成細(xì)胞檢測(cè)，巖藻多糖高劑量組溶血空斑數(shù)明顯升高（P＜0.05）；高、中劑量巖藻多糖組半數(shù)溶血值明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），結(jié)果見表 2。

表2 巖藻多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響（n=10，±s）Table 2 Effect of Fucoida to humoralimmunity function in mice

表2 巖藻多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響（n=10，±s）Table 2 Effect of Fucoida to humoralimmunity function in mice

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 溶血空斑數(shù)（/106脾細(xì)胞） 半數(shù)溶血值（HC50）對(duì)照組 256±51 145.5±8.2低劑量巖藻多糖組 315±37 161.4±9.1中劑量巖藻多糖組 349±33 173.9±6.3*高劑量巖藻多糖組 365±46* 180.5±7.1**

由表2可知，巖藻多糖能刺激小鼠體液免疫應(yīng)答，增強(qiáng)體液免疫功能。

2.3 巖藻多糖對(duì)小鼠腹腔單核－巨噬細(xì)胞功能的影響

小鼠連續(xù)灌胃20 d后，巖藻多糖高劑量組小鼠腹腔單核－巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05）；吞噬指數(shù)明顯提高（P＜0.05），結(jié)果見表3。

表3 巖藻多糖對(duì)小鼠腹腔單核-巨噬細(xì)胞功能的影響（n=10，±s）Table 3 Effect of Fucoida to monocyte-macrophage function in mice

表3 巖藻多糖對(duì)小鼠腹腔單核-巨噬細(xì)胞功能的影響（n=10，±s）Table 3 Effect of Fucoida to monocyte-macrophage function in mice

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 吞噬率/% 吞噬指數(shù)對(duì)照組 21.8±3.7 0.30±0.06低劑量巖藻多糖組 24.6±2.4 0.35±0.04中劑量巖藻多糖組 27.1±3.3 0.37±0.02高劑量巖藻多糖組 28.5±4.2* 0.41±0.09*

由表3可知，巖藻多糖能增強(qiáng)小鼠腹腔單核－巨噬細(xì)胞功能，提高腹腔單核－巨噬細(xì)胞吞噬率。

2.4 巖藻多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)顯示：巖藻多糖高、中劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值差（ΔOD）明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），表明巖藻多糖能增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能，提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果見表4。

表4 巖藻多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響（n=4，±s）Table 4 Effect of Fucoida to cellular immunity function in mice

表4 巖藻多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響（n=4，±s）Table 4 Effect of Fucoida to cellular immunity function in mice

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 轉(zhuǎn)化值（OD） 轉(zhuǎn)化值差（ΔOD）對(duì)照組 0.581低劑量巖藻多糖組 0.630±0.187 0.049中劑量巖藻多糖組 0.702±0.016 0.121*高劑量巖藻多糖組 0.740±0.063 0.159*

由表4可知，巖藻多糖能增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能，提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。

3 討論

人類已從海洋生物中獲得了4 000多種活性物質(zhì)[5]，巖藻多糖就是其中的一種。其主要成分是L－巖藻糖，是一種硫酸多糖，現(xiàn)已分離和鑒定了3種不同分子結(jié)構(gòu)的巖藻多糖即G型、F型與U型巖藻多糖。這3種巖藻多糖均有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抗凝血、抗HIV病毒、抗血栓、避孕、清除自由基、促進(jìn)組織再生等作用[6－7]。

人體的自由基增多時(shí)，就可損傷細(xì)胞，導(dǎo)致癌變。巖藻多糖具有誘尋癌細(xì)胞慢慢地自行滅亡的作用，被譽(yù)為一種天然防癌劑[8]。有研究表明：海藻多糖抑制腫瘤的效果，不是直接作用于腫瘤細(xì)胞，由于天然化合物中的多糖類成分大多具有免疫活性，因此，海藻多糖抑制腫瘤作用可能與提高生物機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的防御能力有關(guān)[9]。本研究采用小鼠灌胃給予高、中、低 3 個(gè)劑量（0.1、0.2、0.5 g/kg）巖藻多糖，測(cè)定了小鼠脾臟／體重比值、胸腺／體重比值、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核－巨噬細(xì)胞功能等免疫指標(biāo)。結(jié)果顯示：高、中劑量組巖藻多糖能顯著提高小鼠脾臟／體重比值和胸腺／體重比值（P＜0.05）；高、中劑量組能顯著增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能（P＜0.05））；高劑量組能明顯增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能、單核－巨噬細(xì)胞功能（P＜0.05）。由此可見：巖藻多糖具有顯著的增強(qiáng)免疫活性有的作用，其抗腫瘤作用可能與提高機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫功能有關(guān)。

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[1]薛山,趙國(guó)華.低分子質(zhì)量巖藻多糖的制備與生物學(xué)功能研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·創(chuàng)新版,2009,6(6):35－37

[2]Catherine B,Elizaheth F,Cathenne B V,et al.Inhibition of complement activation by natural sulfated Dolvsaccharides(fucans)from brown seaweed[J].Molecular immunology,2006,31(4):247－253

[3]潘志強(qiáng).酶降解的枸杞多糖免疫增強(qiáng)作用實(shí)驗(yàn)研究[J].藥物研究,2010,19(24):13－14

[4]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:1420－1426

[5]程仕偉,陳超男,馮志彬,等.海帶巖藻多糖的水提制備及其抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2010,31(6):101－104

[6]CHEN Y,XIE MY,NIE S P.Purification,composition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum[J].Food chemistry,2008,107(1):231－241

[7]Andrew C Lake,Roger Vassy,Mélanie Di Benedetto,et al.Low Molecular Weight Fucoidan Increases VEGF165 －induced Endothelial Cell Migration by Enhancing VEGF165 Binding to VEGFR－2 and NRP1 J[J].Biol Chem,2006,281(37):844－852

[8]張華,孫婕,鄒春虹,等.低分子量巖藻多糖的生產(chǎn)途徑及藥理作用[J].中國(guó)甜菜糖業(yè),2006,12(4):31－33

[9]TSENG Y H,YANG J H,MAU J L.Antioxidant properties of polysaccharides from Ganoderma tsugae[J].Food chemistry,2008,107:732－738