酶電極法測(cè)定雞精中谷氨酸鈉含量

馮東，王丙蓮，*，李雪梅，李大海，劉仲惠

（1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南 250014；2.山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014）

雞精，是以雞肉粉、鮮味劑、淀粉、蔗糖、食鹽等為原料，經(jīng)過(guò)配制、混合、造粒、干燥等過(guò)程加工而成的一種具有雞肉鮮香風(fēng)味的調(diào)味品，因其特有的風(fēng)味而越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前人們多用雞精做湯料的增味劑，谷氨酸鈉（麩氨酸鈉）是味精的主要成分，也是雞精產(chǎn)品中的主要鮮味物質(zhì)，作為雞精產(chǎn)品的主要原料，其含量一般標(biāo)示量為35%左右[1]。由于雞精類(lèi)產(chǎn)品中谷氨酸鈉檢測(cè)目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，而某些企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中也未制定谷氨酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，雖然相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中谷氨酸鈉主要測(cè)定方法有3種—高氯酸滴定法、旋光法和酸度計(jì)法[2－5]，但由于雞精成分比味精復(fù)雜得多，其中旋光性和水不溶性物質(zhì)的存在，導(dǎo)致上述方法不適用。而高效液相色譜分析費(fèi)用昂貴且操作復(fù)雜，因此建立一種切實(shí)可行的、適合于雞精中谷氨酸鈉含量的測(cè)定方法成為必要。

酶電極分析法是將酶蛋白分子采用交聯(lián)作用固定化制成固定化酶膜，再與電化學(xué)基礎(chǔ)電極相結(jié)合，構(gòu)成酶電極生物傳感器用于特異性底物分析的一項(xiàng)生物技術(shù)。該方法具有專(zhuān)一性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)快速而靈敏等特點(diǎn)[6]。酶電極研究起步于20世紀(jì)60年代，自2000年以來(lái)，生物傳感器技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測(cè)[7]、食品安全[8]、軍事[9]和醫(yī)學(xué)[10－11]等方面的應(yīng)用日益廣泛，其用于食品谷氨酸、谷氨酸鈉的檢測(cè)研究較少[12]。本研究中，我們采用谷氨酸酶電極分析儀測(cè)定雞精中谷氨酸鈉的含量，并對(duì)其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，通過(guò)重現(xiàn)性和回收率等試驗(yàn)，證明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、高效，具有實(shí)際使用意義。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

谷氨酸氧化酶膜：谷氨酸氧化酶SIGMA公司生產(chǎn)，利用戊二醛交聯(lián)法制成固定化酶膜圈，置于冰箱待用；緩沖溶液為0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸緩沖液；采用市售雞精；谷氨酸對(duì)照品；其它試劑均為分析純。

SBA－40E生物傳感分析儀由山東省科學(xué)院生物研究所自制。

1.2 測(cè)定原理

生物傳感分析儀SBA－40E利用酶促反應(yīng)來(lái)定量，其樣品分析原理如下：

SBA－40E生物傳感分析儀結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

樣品室側(cè)面裝有過(guò)氧化氫電極，電極表面覆蓋固定化的谷氨酸氧化酶酶膜。含有谷氨酸鈉的底物在樣品室內(nèi)與固定化谷氨酸氧化酶層接觸并反應(yīng)，產(chǎn)生的H2O2由過(guò)氧化氫電極檢測(cè)并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，該電流信號(hào)經(jīng)放大處理顯示測(cè)定結(jié)果，并自動(dòng)記錄和打印。因?yàn)楫a(chǎn)生的H2O2的量與谷氨酸質(zhì)量濃度成線性比例關(guān)系，故可測(cè)定樣品中谷氨酸含量，進(jìn)而換算得谷氨酸鈉含量。

酶電極及固定化酶膜結(jié)構(gòu)如圖2所示。

電極系統(tǒng)包括兩個(gè)酶電極及其插頭，固定化谷氨酸氧化酶酶層通過(guò)酶膜片及O型密封圈固定于酶電極頂端。系統(tǒng)通過(guò)固定化酶層實(shí)現(xiàn)對(duì)谷氨酸、谷氨酸鈉的催化反應(yīng)，生成的H2O2由過(guò)氧化氫電極檢測(cè)并顯示，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)谷氨酸、谷氨酸鈉的測(cè)定。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱量谷氨酸，蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度依次為0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL 的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封放置，用于檢驗(yàn)生物傳感分析儀的線性范圍和檢測(cè)靈敏度。

1.3.2 SBA－40E生物傳感分析儀環(huán)境要求

該分析儀需要0.5平方米的工作臺(tái)，工作臺(tái)平整潔凈，避免日曬。操作環(huán)境溫度要求15℃～35℃，相對(duì)濕度低于90%。

1.3.3 測(cè)定步驟

1.3.3.1 SBA－40E生物傳感分析儀定標(biāo)

為保持谷氨酸酶膜活性，系統(tǒng)緩沖劑采用0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸鹽緩沖液。采用100 mg/100 mL谷氨酸溶液作為分析儀定標(biāo)液。SBA－40E生物分析儀開(kāi)機(jī)后，系統(tǒng)進(jìn)行自檢，后指示燈提示進(jìn)樣。用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確吸取25 μL定標(biāo)液快速注入反應(yīng)室，儀器自行運(yùn)轉(zhuǎn)，并顯示測(cè)定結(jié)果。根據(jù)儀器提示用谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)定標(biāo)幾次，最終SBA－40E自動(dòng)定標(biāo)為100，然后可進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.3.3.2 雞精樣品測(cè)定

精確稱取適量雞精樣品，蒸餾水使其充分溶解，并按一定比例稀釋?zhuān){(diào)整pH為6～8。根據(jù)分析儀“進(jìn)樣”指示，準(zhǔn)確吸取25 μL稀釋的雞精樣品，并注入反應(yīng)池。反應(yīng)20 s后分析儀自行顯示并打印測(cè)定結(jié)果，根據(jù)分析儀測(cè)定數(shù)值，結(jié)合雞精稀釋倍數(shù)和谷氨酸、谷氨酸鈉換算系數(shù)，即可計(jì)算雞精中谷氨酸鈉含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用t檢驗(yàn)分析，比較液相色譜儀法與SBA－40E生物傳感分析儀測(cè)定結(jié)果之間的顯著性差異，判斷SBA－40E生物傳感分析儀能否達(dá)到液相色譜儀對(duì)谷氨酸鈉檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定的最適pH

谷氨酸氧化酶作為一種蛋白質(zhì)，過(guò)酸或過(guò)堿環(huán)境均導(dǎo)致其活性下降，以致失活，從而嚴(yán)重影響SBA－40E分析儀測(cè)定的準(zhǔn)確度。本試驗(yàn)采用磷酸鹽緩沖體系，配制pH 1～10的緩沖液，結(jié)果表明，pH7.0左右時(shí)谷氨酸氧化酶酶活性最高。鑒于此，SBA－40E生物傳感分析儀系統(tǒng)選用pH7.2的磷酸緩沖液。待測(cè)雞精樣品溶液需調(diào)整pH到6～8，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿樣品液均將導(dǎo)致谷氨酸氧化酶酶膜失活。

2.2 線性范圍確定

上述試驗(yàn)條件下，分別測(cè)定谷氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL），進(jìn)樣體積25 μL。依據(jù)SBA－40E生物傳感分析儀顯示結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3。

圖3結(jié)果表明，在1 mg/100 mL～100 mg/100 mL范圍內(nèi)，SBA－40E生物傳感分析儀顯示值與谷氨酸的質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系。谷氨酸質(zhì)量濃度為X，顯示值為Y，線性回歸方程為：y=0.999 19－0.033 2x，相關(guān)系數(shù)R為0.999 86。該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的谷氨酸可由SBA－40E直接檢測(cè)。超出該質(zhì)量濃度范圍時(shí)，SBA－40E顯示值遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離回歸曲線，由此可判斷該方法對(duì)谷氨酸的檢測(cè)下限與檢測(cè)上限分別為1mg/100mL、100 mg/100 mL，相應(yīng)的谷氨酸鈉的檢測(cè)下限、檢測(cè)上限分別為1.27 mg/100 mL、127 mg/100 mL。谷氨酸鈉質(zhì)量濃度高于其檢測(cè)上限時(shí)需要稀釋測(cè)定。

2.3 該方法的回收率檢驗(yàn)

本研究利用回收試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。最佳試驗(yàn)條件下，取市售3種品牌雞精樣品，稀釋后每個(gè)樣品平均分成2份，其中一份加入等體積質(zhì)量百分比濃度為30%的谷氨酸鈉對(duì)照溶液做回收試驗(yàn)。按照“1.3.3”步驟測(cè)定各試樣谷氨酸鈉含量。由回收率計(jì)算公式：P=（加標(biāo)試樣測(cè)定值－試樣測(cè)定值）/加標(biāo)量×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率（n=5）Table 1 Recovery of standard addition（n=5）

由表1中的數(shù)據(jù)可知，用酶電極法測(cè)定雞精樣品回收率為99.3%～101.2%，處于98%～102%之間，表明該方法用于雞精中谷氨酸鈉含量的測(cè)定準(zhǔn)確度較高。

2.4 酶電極法與高效液相色譜法測(cè)定雞精谷氨酸鈉含量的對(duì)比試驗(yàn)

取5種雞精樣品，按相應(yīng)倍數(shù)稀釋后，分別用酶電極法、高效液相色譜法（HPLC）、高氯酸滴定法進(jìn)行谷氨酸鈉含量測(cè)定。每個(gè)測(cè)試重復(fù)6次，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 雞精谷氨酸鈉含量對(duì)比測(cè)試結(jié)果（n=6）Table 2 Comparative test results for sodium glutamate in chicken essence between SBA-40E and HPLC，perchloric acid titration

表2數(shù)據(jù)顯示，測(cè)定雞精中谷氨酸鈉含量，酶電極法與高效液相色譜法、高氯酸滴定法相比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。綜上表明，采用酶電極法檢測(cè)雞精中谷氨酸鈉含量準(zhǔn)確度高亦較高，而酶電極法較之液相色譜分析和高氯酸滴定具備操作簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)勢(shì)，故SBA－40E生物傳感分析儀有望代替高效液相色譜、高氯酸滴定法等，成為測(cè)定雞精中谷氨酸鈉含量的新方法、新手段。

2.5 該方法的專(zhuān)一性驗(yàn)證

作為食品添加劑的5′鳥(niǎo)苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2、白糊精等與谷氨酸鈉共存于雞精，本試驗(yàn)驗(yàn)證了酶電極法對(duì)谷氨酸鈉的檢測(cè)專(zhuān)一性及其抗干擾能力。配制5′鳥(niǎo)苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2、白糊精等干擾物的質(zhì)量濃度為50 mg/100mL的溶液，利用SBA－40E進(jìn)行含量測(cè)定，并以50 mg/100mL的谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 SBA-40E生物傳感器的專(zhuān)一性試驗(yàn)（n=6）Table 3 Specificity test of the biosensor SBA-40E for sodium glutamate mg/100 mL

由表3可以看出，SBA－40E能夠準(zhǔn)確測(cè)定溶液中谷氨酸鈉含量，而對(duì)其它幾種雞精中的食品添加劑均無(wú)明顯響應(yīng)，說(shuō)明該方法對(duì)雞精谷氨酸鈉的專(zhuān)一性較高，用于雞精中谷氨酸鈉含量測(cè)定時(shí)能有效排除其它常見(jiàn)雜質(zhì)的干擾。

2.6 該方法的重現(xiàn)性

取某品牌雞精樣品分為6份，采用酶電極法對(duì)稀釋為100 mg/100 mL的雞精樣品谷氨酸鈉進(jìn)行測(cè)定，觀察SBA－40E的重現(xiàn)性，結(jié)果如表4。

表4 SBA-40E的重現(xiàn)性試驗(yàn)Table 4 Reproduicibility test of the biosensor SBA-40E %

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.74%。該試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該方法用于雞精谷氨酸鈉檢測(cè)具有較好的重現(xiàn)性。

2.7 該方法的穩(wěn)定性

運(yùn)用SBA－40E生物傳感分析儀對(duì)已知濃度的谷氨酸鈉溶液進(jìn)行測(cè)試，每5天測(cè)定1次，每次6個(gè)平行，連續(xù)測(cè)定3個(gè)月，考察分析儀的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)顯示，分析儀測(cè)試結(jié)果沒(méi)有明顯變化，酶膜活性穩(wěn)定，這說(shuō)明谷氨酸氧化酶酶膜3個(gè)月內(nèi)能保持較高活性，SBA－40E生物傳感器在此期間亦具有良好的穩(wěn)定性。3個(gè)月后可通過(guò)更換谷氨酸氧化酶酶膜實(shí)現(xiàn)酶電極分析儀的繼續(xù)使用。

3 結(jié)論

本研究利用生物傳感技術(shù)建立了SBA－40E型傳感分析儀，創(chuàng)建了簡(jiǎn)潔、快速檢測(cè)雞精谷氨酸鈉含量的新方法。該方法直接測(cè)定雞精中的谷氨酸鈉，無(wú)需進(jìn)行樣品前處理；檢測(cè)靈敏度高，檢出下限為1.27 mg/100 mL；加標(biāo)回收率高，為99.3%～101.2%；檢測(cè)速度快，每個(gè)樣品測(cè)試僅需20 s；檢測(cè)專(zhuān)一性強(qiáng)，不受雞精中其他添加劑，5′鳥(niǎo)苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2和白糊精等的干擾；重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好；結(jié)果準(zhǔn)確可靠，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%；與高效液相色譜儀等相比較，其測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05）；線性范圍寬，適用于目前絕大部分雞精樣品中的谷氨酸鈉含量測(cè)定；且該方法操作簡(jiǎn)單，使用成本低，可使用分析純?cè)噭m于味精行業(yè)中谷氨酸鈉含量的監(jiān)控。因此，本方法有望代替高效液相色譜法和高氯酸滴定法，成為當(dāng)前雞精等調(diào)味料生產(chǎn)過(guò)程中谷氨酸、谷氨酸鈉等監(jiān)控的新方法。

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[1]管有根,周侃.雞精中谷氨酸鈉含量的測(cè)定[J].中國(guó)釀造,2004(10):32－33

[2]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 8967－2007谷氨酸鈉(味精)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.43－2003味精衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004

[4]中華人民共和國(guó)輕工業(yè)部.QB 1500－92味精[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1992

[5]李艷松.關(guān)于味精中谷氨酸鈉含量測(cè)定方法的探討[J].廣西輕工業(yè),2007(5):8－10

[6]張先恩.生物傳感器原理和特點(diǎn)、生物傳感原理與應(yīng)用[M].長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1991:14－20

[7]Timur S,Anik U,Odaci D,et al.Development of a microbial biosensor based on carbon nanotube(CNT)modified electrodes[J].Electrochemistry Communications,2007,9(8):1810－1815

[8]Volpe E,Cappelli G,Grassi M,et al.Gene expression profiling of human macrophages at late time of infection with mycobacterium tuberculosis[J].Immunology,2006,118(4):449－460

[9]Taylor C J,Bain L A,Richardson D J,et al.Construction of a whole cell gene reporter for the fluorescent bioassay of nitrate[J].Anal Bio Chem,2004,328(1):602－606

[10]Zeng H,Wang H,Chen F P.Development of Quartzcrystal Microbalance Based Immunosensor Array for Clinical Immunophenotyping of Acute Leukemias[J].Analytical Biochemistry,2006,351(1):69－76

[11]Pastorino L,Caneva S F,Giacomini M,et al.Development of a piezoelectric immunosensor for the measurement of paclitaxel[J].Immunol Methods,2006,313(1/2):191－198

[12]Basu A K,Chattopadhyay P,Roychudhuri U,et al.A biosensor based on co－immobilized L－glutamate oxidase and L－glutamate dehydrogenase for analysis of monosodium glutamate in food[J].Biosensors and bioelectronics,2006,21:1968－1972