熒光分光光度計(jì)快速測(cè)定番茄醬中微生物數(shù)量

曹鵬，楊瑞麗，徐小琳，薛梅

（石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832003）

新疆是中國(guó)重要的加工番茄產(chǎn)區(qū)[1-2]，番茄制品出口量約占全國(guó)的90%，為亞洲第一[3]，其產(chǎn)量逐年上升。

但由于檢測(cè)手段不統(tǒng)一，效率低，準(zhǔn)確性不高，番茄醬出口遭遇了越來(lái)越多的技術(shù)壁壘；特別是微生物的相關(guān)檢驗(yàn)已不能滿足國(guó)際市場(chǎng)的需求[4]。國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局雖頒發(fā)了SN/T2376-2009《番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法》，但其檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，仍屬于事后檢測(cè)的范圍。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，每有一個(gè)包裝箱番茄醬質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題，對(duì)工廠造成的直接損失約有4000元人民幣[5]，因此迫切需要一種快速的、屬于事中檢測(cè)的微生物檢驗(yàn)方法。目前微生物計(jì)數(shù)的常規(guī)方法有平板稀釋計(jì)數(shù)法[6]、濁度法[7]、血球板計(jì)數(shù)法[8]、菌體干重法[9]等。第一種方法較繁瑣，復(fù)雜性差，耗時(shí)長(zhǎng)，不能及時(shí)反映菌體生長(zhǎng)情況，不適合大批量檢測(cè)使用；后幾種方法不能有效的區(qū)分細(xì)胞的死活，無(wú)法準(zhǔn)確的表示番茄醬中具有活性的微生物的數(shù)量，且受培養(yǎng)基、代謝產(chǎn)物的影響較大[10]，也不適合大批量的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)使用熒光分光光度法檢測(cè)番茄醬中的活性微生物，簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適于工廠大規(guī)模檢測(cè)的使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄醬（新疆某番茄醬廠提供，滅菌，4℃密封保存）；供試微生物（從腐敗番茄醬中篩選的嗜熱耐酸桿菌，搖瓶培養(yǎng) 24 h）；吖啶橙（AO）（1×10-4mol/L，4 ℃封裝保存，西安化學(xué)試劑廠）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（5×10-2mol/L，滅菌，室溫保存，西安化學(xué)試劑廠）。

熒光分光光度計(jì)（F-2500）：日立；生物顯微鏡（XS-213）：江蘇無(wú)錫冶金科技有限公司；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 番茄醬中微生物的分離

準(zhǔn)確稱取番茄醬1.0 g，加入15 mL無(wú)菌水，充分混勻，移取1.5 mL混合液于1.5 mL的離心管中；另取1.5 mL菌液于另一離心管中，設(shè)置一系列轉(zhuǎn)速（600、800、1 000、1 200、1 400 r/min） 和時(shí)間（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 min）離心觀察醬和菌的分離情況。

1.2.2 單因素和正交試驗(yàn)

秋風(fēng)漸起，紫云內(nèi)心崩潰了，找到夏梓桑，要了他的電話，委托他轉(zhuǎn)交一封信，信中有一份離婚協(xié)議?；氐阶√?，紫云趕緊收拾行李，重要證件都放進(jìn)一個(gè)黑色LV公文包里，連夜離開(kāi)上海。列車西去，夏梓桑在站臺(tái)上向她揮手。

熒光分光光度計(jì)掃描吖啶橙溶液；激發(fā)波長(zhǎng)為538 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為290 nm。依預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定初始條件為：番茄醬1.0 g加入15 mL無(wú)菌水中混勻成番茄醬液；錐形瓶中加入菌液1.0 mL、番茄醬液4.0 mL、SDS1.0 mL混勻，再加入0.3 mL～0.9 mL AO，最終加無(wú)菌水定容至8.0 mL；將其充分振蕩并染色15 min后取1.5 mL進(jìn)行離心；取離心后0.5 mL上清液微孔濾膜減壓過(guò)濾；用5.0 mL無(wú)菌水清洗濾膜上的微生物于比色皿，并以525.5 nm處熒光值評(píng)價(jià)吖啶橙用量對(duì)測(cè)定效果的影響。

在上述得到最佳AO用量的基礎(chǔ)上，其他條件不變，分別改變番茄醬液（1.5 mL～4.5 mL）、SDS（0.4 mL～1.6 mL）和染色時(shí)間（15 min～75 min），確定最佳番茄醬液用量、SDS用量和染色時(shí)間。并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定最佳檢測(cè)條件。

1.2.3 活菌數(shù)測(cè)定

取1 mL菌液加入到99 mL無(wú)菌水中，充分振蕩15 min～20 min；用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，根據(jù)菌液的稀釋倍數(shù)，計(jì)算每毫升菌液中的菌數(shù)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分 別 取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 的 菌液，按最佳檢測(cè)條件測(cè)定熒光值，以熒光值為縱坐標(biāo)，每克番茄醬中的活菌數(shù)為橫坐標(biāo)，建立回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄醬與微生物的分離

由于番茄醬本身較黏稠，只有將微生物從番茄醬中分離出來(lái)，才能在分光光度計(jì)中測(cè)定。1 000 r/min離心5.0 min后，番茄醬能有效的沉淀；而菌液中的微生物基本不產(chǎn)生沉淀，可以達(dá)到較好的分離效果。

2.2 單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果

不同吖啶橙用量對(duì)熒光值的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

當(dāng)AO含量較小時(shí)，增加AO用量可以提高熒光強(qiáng)度并在0.7 mL時(shí)達(dá)到峰值。隨后隨著AO濃度的增加熒光值反而下降。在溶液相中，AO存在單體與二聚體的平衡轉(zhuǎn)化，而其二聚體不產(chǎn)生熒光；當(dāng)AO濃度較大時(shí)，平衡向二聚體方向轉(zhuǎn)化，體系熒光值就會(huì)降低。因此體系中吖啶橙濃度不宜過(guò)大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇加入0.7 mL。

2.2.2 番茄醬液用量對(duì)測(cè)定效果的影響

不同番茄醬液用量對(duì)熒光值的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

當(dāng)番茄醬液用量較少時(shí)，增加番茄醬液用量可以提高熒光強(qiáng)度并在2.5 mL時(shí)達(dá)到峰值。增加番茄醬液用量提高了體系中微生物的數(shù)量，熒光值也隨之加強(qiáng)。但是加入的番茄醬液過(guò)多后，體系的粘稠度快速增加，加大了離心分離微生物的難度，回收的微生物相對(duì)減少，熒光值也隨之下降。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇加入2.5 mL番茄醬液。

2.2.3 SDS用量對(duì)測(cè)定效果的影響

不同SDS用量對(duì)熒光值的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

當(dāng)SDS含量較小時(shí)，增加SDS用量可以提高熒光強(qiáng)度并在0.6 mL時(shí)達(dá)到峰值。隨后隨著SDS濃度的增加熒光值反而下降。在無(wú)表面活性劑存在的情況下，AO以單體和二聚體的狀態(tài)共存（以單體為主），當(dāng)加入的SDS較低或較高時(shí)，體系中的二聚體比例增加，此濃度接近“預(yù)膠束”的生成濃度，在此階段形成了微小分子集合體且主要以二聚體形式存在，二聚體無(wú)熒光，故熒光強(qiáng)度相對(duì)較低；當(dāng)SDS的用量為0.6 mL時(shí)，“預(yù)膠束”大量生成，AO分子比較均勻地分配到這些集合體中，AO單體相應(yīng)增加，二聚體減少，熒光強(qiáng)度升高[11]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇加入0.6 mL SDS。

2.2.4 染色時(shí)間對(duì)測(cè)定效果的影響

不同染色時(shí)間對(duì)熒光值的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

當(dāng)染色時(shí)間較小時(shí)，增加染色時(shí)間熒光值反而下降，并于染色45 min后趨于平穩(wěn)。由于番茄醬中成分較多，體系中的某些物質(zhì)可能影響到了染料分子與菌體的結(jié)合，因此染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇染色時(shí)間15 min。

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在上述實(shí)驗(yàn)得出的較佳條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，其結(jié)果如表1、表2所示。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of orthogonal experiment

由表1可知，熒光法快速測(cè)定活菌數(shù)的最佳組合為 A3B2C3D3，即吖啶橙用量 0.75 mL、染色 15 min、番茄醬液用量2.8 mL、十二烷基磺酸鈉用量0.7 mL，各因素對(duì)熒光強(qiáng)度影響主次順序?yàn)椋哼灌こ醛儠r(shí)間﹥番茄醬液﹥十二烷基磺酸鈉；由表2的方差分析結(jié)果進(jìn)一步可以看出，吖啶橙和染色時(shí)間對(duì)測(cè)定效果影響顯著，而十二烷基磺酸鈉和番茄醬對(duì)測(cè)定效果影響不顯著。

表2 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 2 Orthogonal design of variance analysis

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件（即吖啶橙0.75 mL、十二烷基磺酸鈉0.7 mL、番茄醬液2.8 mL和染色15 min）下，依次加入1.0 mL～7.0 mL的菌液染色后測(cè)定熒光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

3 結(jié)論

熒光法快速測(cè)定番茄醬中活菌數(shù)的最佳測(cè)定條件是：吖啶橙0.75 mL、十二烷基磺酸鈉0.7 mL、番茄醬液2.8 mL和染色時(shí)間15 min。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)熒光法測(cè)定番茄醬中活菌數(shù)進(jìn)行了探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光值與活菌數(shù)呈良好的線性關(guān)系，可以確定番茄醬中的活菌數(shù)。

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