葉酸和維生素B12對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

張景燕 陳 娟 王 蓉 趙靜姝 吳燕川

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京老年病醫(yī)療研究中心，北京100053)

老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能損害和記憶力減退為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口老齡化不斷加劇，AD的發(fā)病率和患病率逐年增加，研究如何防治AD、降低發(fā)病率勢在必行［1］。Piazza等［2］認(rèn)為機(jī)體內(nèi)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)增高可致神經(jīng)細(xì)胞毒性，是誘發(fā)AD的因素之一，而Hcy是含硫的氨基酸，需要通過人體必需氨基酸甲硫氨酸(Hcy的唯一前體)代謝脫去甲基后形成。體內(nèi)Hcy濃度受到各種因素的影響，最常見的如飲食中葉酸和維生素B12缺乏，即可引起Hcy濃度增高，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生［3］。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察葉酸和維生素B12對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的影響，探討葉酸和維生素B12對神經(jīng)細(xì)胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1)細(xì)胞株:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。

2)試劑:葉酸和維生素B12系SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品。MTT〔噻唑藍(lán)，3-(4，5-dimethylthyl thiazo-l 2-yl)-2，5diphenyltetrazolium broide〕系 Sigma公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)系北京亞太精細(xì)化工公司產(chǎn)品。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑系北京森美希康試劑公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1)細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d傳代1次，中間換液1次。

2)MTT代謝率測定:將生長良好、傳代穩(wěn)定的SH-SY5Y細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板(Nunc產(chǎn)品)，每孔體積200 μL，48 h后分為4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。包括:對照組、葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組，各組細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)液體積均相等，于接種后第3天，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，37℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 200 μL，振搖 10 min，用全波長酶標(biāo)儀(multiskan spectrum)測定550 nm處吸光度值(A)。

3)LDH漏出率測定:將SY5Y細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于48孔板，每孔體積500 μL，48 h后分組(同MTT代謝率測定)。于接種后第3天留取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，用日立7170生化分析儀進(jìn)行酶法測定。

4)細(xì)胞計(jì)數(shù):將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104/mL的密度接種于48孔板，每孔體積500 μL，48 h后分組(同MTT代謝率測定)。于接種后3 d對各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

5)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察:倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測定

MTT檢測結(jié)果顯示，葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組可使SH-SY5Y細(xì)胞MTT代謝率升高，線粒體活性增強(qiáng)，與對照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對SH-SY5Y細(xì)胞MTT代謝率的影響Tab.1 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the metabolic rate in SH-SY5Y

2.2 LDH漏出率測定

用酶法測定的LDH漏出率結(jié)果顯示，與對照組相比，葉酸組、維生素B12組、葉酸+維生素B12組SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率降低，說明細(xì)胞死亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2)。

表2 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率的影響Tab.2 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the LDH leakage rate in SH-SY5Y

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，SH-SY5Y細(xì)胞中分別加入葉酸、維生素B12以及葉酸和維生素B12共同作用后，細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對照組，進(jìn)行數(shù)據(jù)比較后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。

表3 葉酸、維生素B12、葉酸+維生素B12對SH-SY5Y細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Tab.3 Effect of folic acid，vitamin B12，folic acid+vitamin B12 on the cell count in SH-SY5Y

3 討論

葉酸又稱蝶酰谷氨酸，是B族維生素，由喋啶核、對氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成，人體不能自行合成，葉酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成葉酸的活性型四氫葉酸。維生素B12也屬B族維生素，在葉酸的代謝中必不可少，并且都是同型半胱氨酸(Hcy)合成蛋氨酸的輔酶。葉酸能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，在調(diào)控神經(jīng)生成和程序性細(xì)胞死亡中起重要作用。

由于機(jī)體內(nèi)Hcy濃度與葉酸和維生素B12的水平呈負(fù)相關(guān)［4-5］，當(dāng)葉酸和維生素B12在體內(nèi)的水平降低時(shí)，Hcy濃度增高，對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和DNA損傷，從而增加老年性癡呆患病的風(fēng)險(xiǎn)。老年人的日常飲食攝入量較少，可能造成各種營養(yǎng)包括葉酸和維生素B12的缺乏［6-7］，從而影響Hcy的代謝轉(zhuǎn)化，如果能夠及時(shí)的補(bǔ)充營養(yǎng)，尤其是B族維生素(葉酸和維生素B12)可以加強(qiáng)Hcy的代謝，降低血Hcy的含量［8-13］，減緩老年人認(rèn)知功能的減退，對預(yù)防AD起到積極防治作用，同時(shí)，補(bǔ)充葉酸、維生素B12簡單易行，能夠讓老年群體接收。本實(shí)驗(yàn)證明，葉酸、維生素B12對于神經(jīng)細(xì)胞確實(shí)存在保護(hù)作用，尤其是二者合用效果更為明顯，能夠增加細(xì)胞的生長代謝，減少細(xì)胞死亡，此結(jié)果為通過補(bǔ)充葉酸、維生素B12保護(hù)神經(jīng)元、預(yù)防AD提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本研究通過觀察葉酸、維生素B12對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的作用，從細(xì)胞水平上研究了葉酸、維生素B12對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，對于臨床上防治AD具有參考意義。

［1］Alzheimer’s Association.2009 Alzheimer’s disease facts and figures［J］.Alzheimers Dement，2009，5(3):234-270.

［2］Piazza F，Galimberti G，Conti E，et al.Increased tissue factor pathway inhibitor and homocysteine in Alzheimer’s disease［J］.Neurobiol Aging，2012，33(2):226-233.

［3］Sinha M，Saha A，Basu S，et al.Aging and antioxidants modulate rat brain levels of homocysteine and dehydroepiandrosterone sulphate(DHEA-S):implications in the pathogenesis of Alzheimer’s disease［J］.Neurosci Lett，2010，483(2):123-126.

［4］馬啟信，朱愛琴，于梅花.高同型半胱氨酸血癥對高海拔地區(qū)阿爾茨海默病影響的觀察［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(2):24-26.

［5］Kale A，Naphade N，Sapkale S，et al.Reduced folic acid，vitamin B12 and docosahexaenoic acid and increased homocysteine and cortisol in never-medicated schizophrenia patients:Implications for altered one-carbon metabolism［J］.Psychiatry Res，2010，175(1-2):47-53.

［6］Zhu Y，He Z Y，Liu H N.Meta-analysis of the relationship between homocysteine，vitamin B12，folate，and multiple sclerosis［J］.J Clin Neuroscience，2011，18(7):933-938.

［7］Smach M A，Naffeti S，Charfeddine B，et al.Homocysteine，vitamin B-12，folic acid and the cognitive decline in the elderly［J］.Pathol Biol，2012(in press).

［8］Wald D S，Kasturiratne A，Simmonds M.Serum homocysteine and dementia:Meta-analysis of eight cohort studies including 8669 participants［J］.Alzheimers Dement，2011，7(4):412-417.

［9］Koike T，Kuzuya M，Kanda S，et al.Raised homocysteine and low folate and vitamin B-12 concentrations predict cognitive decline in community-dwelling older Japanese adults［J］.Clin Nutr，2008，27(6):865-871.

［10］蔣安杰，方芳，晏勇，等.阿爾茨海默病和血管性癡呆患者血漿同型半胱氨酸和膽堿酯酶水平及其臨床意義探討［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(12):1530-1532.

［11］商秀麗，張鳳英，孟令慧，等.阿爾茨海默病患者血尿酸水平的檢測及意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(5):333-334.

［12］張玉杰，李淑娟，關(guān)明，等.高同型半胱氨酸型高血壓與急性腦梗死的相關(guān)性分析［J］.中國腦血管病雜志，2011，8(12):637-640.

［13］Haghdoost-Yazdia H，F(xiàn)raidounib N，F(xiàn)araji A，et al.High intake of folic acid or complex of B vitamins provides anti-Parkinsonism effect:No role for serum level of homocysteine［J］.Behavioural Brain Research，2012，233(2):375-381.