腦室內(nèi)注射脂多糖大鼠海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化

趙詠梅 呂風(fēng)月 徐群淵

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100069)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種多發(fā)于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性進(jìn)行性變性疾病，其主要病理學(xué)改變是黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失，其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。近年的研究［1］表明，暴露于各種有促炎作用的感染因子或毒素引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)可能是PD發(fā)病的一個重要因素。不同于以往向黑質(zhì)紋狀體部位直接注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)造成黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性的模型［2-3］，本課題組［4］采用側(cè)腦室注射LPS造成全腦炎性反應(yīng)，證明炎性反應(yīng)對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元具有長時程毒性作用。直到LPS注射后24周，大鼠黑質(zhì)部位酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性染色神經(jīng)元數(shù)較注射0.9%氯化鈉注射液(normal saline，NS)的對照組大鼠明顯減少［4-5］，因此，該模型較符合PD中DA能神經(jīng)元慢性變性的特點(diǎn)。同時，由于該模型排除了直接向黑質(zhì)紋狀體部位注射LPS造成的對黑質(zhì)紋狀體部位的機(jī)械性刺激及LPS對神經(jīng)元的直接損傷作用，因此比以往PD模型更好地模擬了腦內(nèi)炎性反應(yīng)引起黑質(zhì)DA能神經(jīng)元慢性變性的過程。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在各種膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多、分布最廣。在PD患者及動物模型中，黑質(zhì)致密部除了大量的DA能神經(jīng)元缺失外，還存在輕至中度的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活［6］。研究［7］顯示，那些周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞較少的DA能神經(jīng)元更易于變性，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞對DA能神經(jīng)元存在保護(hù)作用。另有研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，在PD患者腦內(nèi)，含α-synuclein陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的死亡有關(guān)，其數(shù)量與PD中黑質(zhì)部位神經(jīng)元缺失的嚴(yán)重程度相關(guān)［9］。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD中具有復(fù)雜的作用。我們已有的研究［4］表明，在側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)的腦內(nèi)炎性反應(yīng)模型中，黑質(zhì)部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)“急性激活-靜止-再次激活”狀態(tài)。在本研究中，我們主要觀察大鼠側(cè)腦室注射LPS后海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況及表達(dá)的變化，以進(jìn)一步研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在DA能神經(jīng)元慢性變性過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康雄性SD大鼠(Sprague-Dawley rats)64只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物分級為無特定病原體級(specific pathogen free，SPF)，動物合格證號:SCXK(京)2007-0001。采用數(shù)字表法隨機(jī)分為NS對照組和LPS實(shí)驗(yàn)組，每組分4個時間點(diǎn)進(jìn)行觀察，即給藥后2、4、12、24周，每個時間點(diǎn)8只大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

腦立體定位儀(Benchmark-900，美國 David KopF)，冰凍切片機(jī)(LEICA CM3050S，德國 Leica公司)，LPS(Sigma公司)，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。Sp免疫組化試劑盒購自Zymed Laboratories公司。Western blotting儀器及Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 腦內(nèi)炎性反應(yīng)大鼠模型制作

6%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。將1 mg LPS溶于800 μL NS中配成1.25 g/L的LPS溶液，新鮮配制，冰凍保存。根據(jù)包新民的大鼠腦立體定位圖譜確定側(cè)腦室注射位點(diǎn)，即前囟后0.8 mm，正中線右旁開1.3 mm，硬膜下3.5 mm。將20 μL NS或濃度為1.25 g/L的LPS注入右側(cè)腦室。注射速度為1 μL/min，共 20 min 注完，留針 15 min，以 1 mm/min的速度緩慢退針，以防LPS沿針道反流溢出。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

大鼠麻醉后經(jīng)左心室灌注NS 250 mL，接著灌注4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛400 mL(pH 7.4)，速度先快后慢，隨后取出腦組織放入4%的多聚甲醛溶液中后固定，24 h后放入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中，待其完全沉底后用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，厚度60 μm。從第三腦神經(jīng)平面開始留取切片，每6個切片取1張，進(jìn)行GFAP抗體免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色主要步驟為:3%H2O2室溫10 min，5%正常羊血清封閉30 min，加入1∶700稀釋的GFAP抗體，陰性對照不加一抗，室溫孵育過夜。1∶300稀釋的生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，1∶300稀釋的辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素抗體室溫孵育2 h，每個步驟間用PBST充分漂洗，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，常規(guī)脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察。

1.5 Western blotting分析

大鼠麻醉后快速斷頭取腦，于冰上剝離雙側(cè)海馬，加入裂解液裂解，離心后取上清液變性，BCA法蛋白定量。電泳時配置10%的分離膠，5%的濃縮膠，腦組織樣品先經(jīng)50 V恒壓電泳后換150 V恒壓電泳，并用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V，3 h)。5%的脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h，1∶20 000稀釋的 GFAP抗體4℃孵育過夜，次日辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL顯色曝片。以β-actin作為內(nèi)參，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，對顯影條帶進(jìn)行吸光度分析。

GFAP蛋白表達(dá)量表示方法:用Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)，Quantity One圖像分析軟件分析得出X片上GFAP條帶的平均吸光度值和面積，及相應(yīng)的βactin條帶的平均吸光度值和面積。首先，分別計算出每個條帶的平均吸光度值與面積的乘積，然后將每個GFAP條帶吸光度值與面積的乘積比上相應(yīng)β-actin吸光度值與面積的乘積，并以相應(yīng)NS對照組大鼠的比值作為1，相應(yīng)LPS實(shí)驗(yàn)組用相對比值表示GFAP表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射LPS后，大鼠海馬部位GFAP陽性細(xì)胞變化

GFAP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，NS對照組大鼠不同時間點(diǎn)海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，均呈未激活狀態(tài)。LPS注射2周后LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活，與相應(yīng)NS對照組相比表現(xiàn)為胞體外形肥大，突起變短增粗，染色加深(圖1)。而到LPS注射后4周和12周時，LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞激活不明顯，細(xì)胞都呈現(xiàn)胞體較小，分支細(xì)、短，染色較淺。到LPS注射后24周時，LPS實(shí)驗(yàn)組海馬部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞又出現(xiàn)極其輕度的激活。

圖1 NS或LPS側(cè)腦室注射2周后大鼠海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemistry of rat hippocampal astrocytes stained with astrocyte-specific marker GFAP antibody at 2 weeks after intra-ventricular injection of NS or LPS(original magnification 400×)

2.2 注射LPS后，大鼠海馬部位GFAP蛋白表達(dá)變化

Western blotting研究結(jié)果表明，NS對照組大鼠不同時間點(diǎn)海馬部位GFAP蛋白表達(dá)量無明顯變化。LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位GFAP蛋白表達(dá)量在LPS注射2周時明顯高于相應(yīng)NS對照組，為相應(yīng)NS對照組的2.39倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.901，P=0.005)(圖2，3)。而4周和12周時，LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位GFAP蛋白表達(dá)量與相應(yīng)NS對照組相比變化不明顯。到LPS注射后24周時，LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位GFAP蛋白表達(dá)量比相應(yīng)NS對照組略有增高，是相應(yīng)NS對照組的1.19倍，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.137，P=0.275)(圖2，3)。

3 討論

在正常生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)起著重要的作用，如參與構(gòu)成神經(jīng)組織網(wǎng)架、維持細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)定、作為能源的儲存部位儲存糖原、吸收和降解某些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)、參與血腦脊液屏障的構(gòu)成等。星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD中的作用較為復(fù)雜。一方面，它可以通過釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗氧化物質(zhì)來保護(hù)DA能神經(jīng)元;而另一方面，它亦可以因某些刺激因素的作用釋放各種炎性細(xì)胞因子對DA能神經(jīng)元起破壞作用。

本課題組以往的研究［4］表明，側(cè)腦室注射 LPS后，大鼠黑質(zhì)紋狀體部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞在LPS注射早期(2周)明顯激活，且GFAP蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)NS對照組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞在LPS注射2周時有明顯激活，且GFAP蛋白表達(dá)量比相應(yīng)NS對照組明顯增加(P＜0.05)，說明側(cè)腦室注射LPS后星形膠質(zhì)細(xì)胞的急性激活并不僅局限于黑質(zhì)部位，腦內(nèi)其他部位(如海馬)也存在星形膠質(zhì)細(xì)胞的急性激活。現(xiàn)普遍認(rèn)為，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)通過血液-中樞神經(jīng)系統(tǒng)接觸面的調(diào)節(jié)、細(xì)胞外離子和神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)的修復(fù)以及為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持等方面，對于神經(jīng)元的存活是有益的［10］。因此，此時星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活對神經(jīng)元主要為保護(hù)作用，是對LPS所引起的損傷的一種保護(hù)性反饋反應(yīng)，且對腦內(nèi)神經(jīng)元(包括海馬部位神經(jīng)元和黑質(zhì)神經(jīng)元)都存在這種保護(hù)作用。

盡管在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活對神經(jīng)元的存活是有益的，然而，長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活對于神經(jīng)元的修復(fù)是否存在保護(hù)作用尚存在爭議。一方面，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生可干擾神經(jīng)元的再生［11］。而且激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放某些毒性物質(zhì)如炎性反應(yīng)因子而參與神經(jīng)變性過程［12］。但另一方面，通過縫隙連接的神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞間接觸和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的營養(yǎng)因子對于神經(jīng)元的存活都是必需的［13］。本研究結(jié)果表明，注射后4和12周，LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞均未見明顯激活，GFAP蛋白表達(dá)量與NS對照組相比也未見明顯差異，說明側(cè)腦室注射LPS后大鼠海馬部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞并非一直處于激活狀態(tài)。到注射后24周時，LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞又出現(xiàn)輕度激活，但LPS實(shí)驗(yàn)組GFAP蛋白表達(dá)量與相應(yīng)NS對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明在LPS注射晚期(24周)，大鼠海馬部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活不如急性期(2周)明顯。我們在以往研究［4］中發(fā)現(xiàn)，注射LPS 24周后大鼠黑質(zhì)紋狀體部位星形膠質(zhì)細(xì)胞激活非常明顯，此時LPS實(shí)驗(yàn)組大鼠黑質(zhì)部位的TH陽性神經(jīng)元數(shù)目也顯著低于相應(yīng)NS對照組，且動物出現(xiàn)明顯的行為學(xué)障礙，提示此時的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活反應(yīng)主要局限于腦內(nèi)黑質(zhì)部位，針對的是黑質(zhì)部位的神經(jīng)元。

總之，本研究觀察到，側(cè)腦室注射LPS后，大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞變化不如黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)明顯，這進(jìn)一步證明了星形膠質(zhì)細(xì)胞在該炎性反應(yīng)模型中具有選擇性作用，黑質(zhì)部位星形膠質(zhì)細(xì)胞很可能參與了黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的變性過程。

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