臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型制備及安全評(píng)估

張立新，陳亞寶，葉 軍，李 林，林 梅，黃俊星，吳正東

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬泰州市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究室1、腫瘤科2，江蘇 泰州 225300)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型制備及安全評(píng)估

張立新1，陳亞寶1，葉 軍1，李 林1，林 梅1，黃俊星2，吳正東2

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬泰州市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究室1、腫瘤科2，江蘇 泰州 225300)

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型制備方法，評(píng)估臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞安全性。方法對(duì)培養(yǎng)至第2、5、8、10、11代的共15例臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行染色體制備，檢查其有無異常。結(jié)果成功制備染色體標(biāo)本，成功率為100%，正常核型率為100%。結(jié)論該臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體制備方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、成功率高。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)至11代時(shí)未見異常染色體核型。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；染色體制備;培養(yǎng)

干細(xì)胞是具有自我更新能力且在適宜微環(huán)境下具有多向分化潛能的原始細(xì)胞。人類間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)可分化形成三個(gè)胚層的終末分化細(xì)胞，故被稱為“各種組織的種子細(xì)胞”，且MSC的應(yīng)用避免了胚胎干細(xì)胞所帶來的倫理問題，故MSCs是目前干細(xì)胞研究中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。MSCs常見來源于脂肪[1]、骨髓[2]、臍血[3]，最近，關(guān)于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)[4]、治療應(yīng)用[5-6]的研究逐漸增多。然而，有研究報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，染色體易變性增高，并提示干細(xì)胞移植存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)[2]，因此，間充質(zhì)干細(xì)胞制品均需監(jiān)測其染色體核型異?？赡躘3，7]，另外，由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可能因胎兒遺傳學(xué)異常，存在異常染色體核型，所以，染色體核型檢查對(duì)于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞更為重要。筆者發(fā)現(xiàn)各種間質(zhì)干細(xì)胞染色體制備方法中條件各有不同[8-9]，而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體的制備方法報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)室在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體檢查中積累了一些成功經(jīng)驗(yàn)，在此做一總結(jié)，以供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 三份臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物，由江蘇北科生物科技有限公司提供。培養(yǎng)至11代，選擇其中的第2、5、8、10、11代共15次標(biāo)本進(jìn)行染色體制備檢查。

1.2 儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品。0.25%EDTA胰酶為美國GIBCO公司出品。秋水仙素制劑由青島萊佛生物工程研究所提供。貼壁培養(yǎng)瓶為Nunclon公司出品。

1.3 方法 每瓶中含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1× 106個(gè)細(xì)胞/10 ml培養(yǎng)液，5%CO2，37℃培養(yǎng)2 d，細(xì)胞呈多角形，相互連接，基本占瓶底50%～70%(見圖1)，加入秋水仙素至0.3 μg/ml，5%CO2培養(yǎng)3 h后，用吸管吸去瓶中液體，加入EDTA胰酶2 ml，搖勻，靜置10～15 min，輕輕拍打瓶底，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓形，懸浮，則加入生理鹽水10 ml混勻后，吸出加入15 ml錐底管中，離心10 min；吸除上清液，加入預(yù)溫至37℃的0.075M KCl溶液12 ml，在37℃溫箱中靜置34 min；向管中加新鮮1:3醋酸、甲醇固定液3 ml，用吸管吹打調(diào)勻，離心10 min，吸除上清液，加固定液10 ml，吹打混勻，靜置30 min，固定重復(fù)3次；最后，離心吸去上清液，0.5 ml固定液重懸細(xì)胞。4℃保存，次日進(jìn)行染色體顯帶(R帶)，分析20個(gè)分裂相。

圖1 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長

2 結(jié)果

16份臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物染色體檢查均獲得滿意的染色體分裂相，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分裂相形態(tài)規(guī)整，染色清晰(圖2)，染色體核型排列見圖3。成功率為100%，正常核型率為100%。

圖2 分裂相

圖3 核型排列圖

3 討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中生長旺盛，一般3 d即可長滿，達(dá)到分瓶傳代要求，而培養(yǎng)第二天時(shí)細(xì)胞生長較為寬松，且細(xì)胞數(shù)亦較多，因此，選擇42～48 h加入秋水仙素，阻滯其分裂相停滯于中期，所得染色體分裂相分散良好；而0.3 μg/ml的秋水仙素終濃度，5%CO2培養(yǎng)3 h，被證實(shí)為分裂相較多，染色體長短適宜，易于分析。另外，CO2培養(yǎng)箱溫度波動(dòng)一定要維持穩(wěn)定，否則細(xì)胞生長不良，分裂相質(zhì)量較差。EDTA胰酶消化后，應(yīng)及時(shí)拍打，在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確保細(xì)胞均已從瓶底脫落，如仍有少量細(xì)胞貼在瓶底，可用吸管吹打至脫落。預(yù)固定時(shí)加入固定液3 ml，濃度略高，以免離心導(dǎo)致細(xì)胞破裂，染色體丟失。最后所制標(biāo)本4℃過夜，有利于染色體分散。

由于MSCs移植可能存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)[2]，而腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞染色體互易、缺失、插入和倒位等為核型的異常改變關(guān)系密切[10]，因此，在美國食品藥品管理局(FDA)關(guān)于MSCs的應(yīng)用程序中安全性評(píng)估提出了對(duì)MSCs染色體核型檢測的要求，同時(shí)，核型分析的異常結(jié)果比癌基因的表達(dá)特異性更高，因此在細(xì)胞治療資格認(rèn)證中進(jìn)行核型分析非常重要。

筆者在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體的制備、分析的過程中取得了滿意效果，同時(shí)，本研究顯示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)至11代時(shí)未見異常染色體核型，此結(jié)果可以作為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用安全的重要證據(jù)。

[1]QinY,Ji H,WuY,et al.Chromosomal instability of murine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in long-term culture and development of cloned embryos[J].Cloning Stem Cells,2009,11(3):445-452.

[2]Josse C,Schoemans R,Niessen NA,et al.Systematic chromosomal aberrations found in murine bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Dev,2010,19(8):1167-1173.

[3]Huang JL,Yang SX.Safety of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells(MSCs)following 5-azaserine induction and inhibition of human cardiac myocyte apoptosis by MSCs[J].Saudi Med J,2009,30(9):1144-1149.

[4]Tong CK,Vellasamy S,Chong Tan B,et al.Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method[J].Cell Biol Int.,2011,35(3):221-226.

[5]Liu Y,Mu R,Wang S,et al.Therapeutic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther,2010,12(6):210.

[6]Sun L,Wang D,Liang J,et al.Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,2010,62(8):2467-2475.

[7]Chen CY,Wu HH,Chen CP,et al.Biosafety assessment of human mesenchymal stem cells engineered by hybrid baculovirus vectors [J].Mol Pharm,2011,18:1505-1514.

[8]陳光平,羅盛康,徐 翔,等.人脂肪干細(xì)胞體外增殖的安全性評(píng)價(jià)[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,27(2):126-129.

[9]劉廣鵬,李宇琳,孫 劍,等.成骨誘導(dǎo)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生物安全性評(píng)價(jià)[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(4):181-184.

[10]Frrhling S,Drhner H.Chromosomal abnormalities in cancer[J].N Engl J Med,2008,359(2):722-734．

Preparation and safety assessment of the chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cells.

ZHANG Li-xin1,CHEN Ya-bao1,YE Jun1,LI Lin1,LIN Mei1,HUANG Jun-xing2,WU Zheng-dong2.
Department of Clinical Medicine Laboratory1,Department of Oncology,People's Hospital of Taizhou City Affiliated to the Medical College of Nantong University,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate methods for preparing chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cells,and to evaluate the safeness.MethodsThe chromosomes of umbilical mesenchymal stem cell cultured for 2,5,8,10,11 generations were prepared and analyzed.ResultsThe chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cell were prepared successfully,with a success rate of 100%.The rate of normal karyotype was 100%.ConclusionThe preparation method is effective and stable,with high success rate.No abnormality was found until the 11thgeneration.

Umbilical mesenchymal stem cell;Chromosome preparation;Cultivation

R392.12

A

1003—6350(2012)13—011—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.005

2012-02-06)

張立新(1974—)，男，江蘇省泰州市人，副主任技師，學(xué)士。