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    PTCL石蠟組織中HTLV-I感染情況的初步研究

    2012-09-05 10:45:58凡琳琳張英愛王識華
    海南醫(yī)學(xué) 2012年13期
    關(guān)鍵詞:病理科石蠟海南省

    凡琳琳,談 順*,饒 翔,張英愛,王識華

    (中南大學(xué)湘雅??卺t(yī)院病理科1、中心實(shí)驗(yàn)室2,海南 ???570208;海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院病理科3,海南 三亞 572000)

    ·論 著·

    PTCL石蠟組織中HTLV-I感染情況的初步研究

    凡琳琳1,談 順1*,饒 翔1,張英愛2,王識華3

    (中南大學(xué)湘雅??卺t(yī)院病理科1、中心實(shí)驗(yàn)室2,海南 ???570208;海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院病理科3,海南 三亞 572000)

    目的檢測外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟包埋組織中HTLV-1感染情況以了解外周T細(xì)胞淋巴瘤(PTCL)各類型與人類T細(xì)胞淋巴瘤病毒Ⅰ型(HTLV-1)的關(guān)系。方法根據(jù)2008年WHO分類法對46例外周T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類,提取外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中人基因組DNA,用PCR方法檢測HTLV-1前病毒。結(jié)果收集到的46例外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中HTLV-1陽性8例,其中HTLV-1在外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特殊型(PTCL-U)、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的檢出率分別為15%、8%、10%、75%。結(jié)論外周T細(xì)胞淋巴瘤存在HTLV-1感染,HTLV-1除與ATLL有密切關(guān)系外,與其他類型外周T細(xì)胞淋巴瘤也有一定關(guān)系。

    外周T細(xì)胞淋巴瘤;HTLV-1;石蠟包埋組織

    外周T細(xì)胞淋巴瘤(Peripheral T cell lymphoma,PTCL)是起源于成熟細(xì)胞或稱胸腺后細(xì)胞的惡性腫瘤。廣義上的PTCL包括除T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病以外的所有T/NK細(xì)胞淋巴瘤。外周T細(xì)胞淋巴瘤是一組具有很強(qiáng)異質(zhì)性的疾病的總和,其病因尚不清楚,研究發(fā)現(xiàn)與免疫缺陷、病毒感染、基因突變等有關(guān)。近年來人類T細(xì)胞淋巴瘤病毒1(Human T cell lymphotropic virus type 1,HTLV-1)與外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系備受關(guān)注,國內(nèi)外學(xué)者幾乎都以患者血液樣本作為實(shí)驗(yàn)材料,罕見應(yīng)用石蠟包埋瘤組織進(jìn)行研究,為進(jìn)一步探討外周T細(xì)胞淋巴瘤與HTLV-1之間的關(guān)系,我們將收集到的經(jīng)石蠟包埋的46例外周T細(xì)胞淋巴瘤依據(jù)2008年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行分類,并運(yùn)用PCR方法檢測。

    1 材料與方法

    1.1 材料來源 收集??谑腥嗣襻t(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及農(nóng)墾三亞醫(yī)院病理科自1995-2010年診斷為外周T細(xì)胞淋巴瘤的石蠟組織,經(jīng)高年資醫(yī)師閱片并結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果最終篩選出外周T細(xì)胞淋巴瘤46例,并依據(jù)2008年WHO最新分類對所篩選出的外周T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類,HTLV-1陽性的人基因組DNA(廈門大學(xué)熊君輝博士提供)作為陽性對照,淋巴結(jié)反應(yīng)性增生石蠟組織作為陰性對照,PCR試劑盒(天根生化科技有限公司),PCR引物合成按參考文獻(xiàn)[2]擴(kuò)增產(chǎn)物為326 bp(見表1)由生工生物(上海)有限公司合成。

    表1 兩對特異性引物

    1.2 方法

    1.2.1HTLV-1 DNA抽提 石蠟組織DNA抽提參照文獻(xiàn)[3],每例標(biāo)本在HE切片對照下,選取病變區(qū)域,以消毒刀片挑取約6 mm×3 mm×0.5 mm大小的石蠟組織塊一片,小心置于0.2 ml PCR管中,并加入1×PCR緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L KCl,pH 9.0)50 μl,以加樣槍頭碎裂組織片。100℃加熱15 min,13 200 r/min離心5 min,吸取蠟層與組織片之間的澄清液作為DNA粗提產(chǎn)物作模板。

    1.2.2HTLV-1前病毒DNA的PCR法檢測 DNA粗提產(chǎn)物8 μl、10×Taq buffer 5 μl、dNTP混合物(2.5 mmol)4 μl、兩種引物各10 μmol/ml、Taq酶(2.5 U/μl)0.5 μl,加水補(bǔ)至50 μl,混勻,石蠟油覆蓋。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性10 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃后延伸7 min。

    1.2.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆及測序 取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加6×2 μl上樣緩沖液于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V,30 min),對照標(biāo)志物無誤后,切下特異性條帶,用膠回收試劑盒(天根)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物,克隆入PGM-T載體(天根),轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top菌株。并由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向序列測定。

    2 結(jié) 果

    依據(jù)2008年WHO分類,我們所收集到得46例T細(xì)胞淋巴瘤具體分類見表2,PCR檢測46例外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1陽性8例(占17.39%),不同類型的外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1的檢出率不同,在外周T細(xì)胞淋巴瘤非特殊型(PTCL-U)、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的檢出率分別為15%、、10%、75%。

    表2 外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1的檢測(n=46)

    用部分PCR產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1,在326 bp處有一條清晰的條帶,與陽性對照一致。回收PCR產(chǎn)物,克隆入T載體并測序后證實(shí)是HTLV-1前病毒DNA的pX區(qū)的部分序列。

    圖1 T細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中HTLV-1前病毒PCR檢測的部分結(jié)果

    3 討論

    HTLV-1是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并整合到人類基因組DNA上,位于pX區(qū)的TAX基因在該病毒的致病過程中發(fā)揮重要作用,主要導(dǎo)致人類T細(xì)胞淋巴瘤(ATLL),因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]合成了針對TAX部分基因片段的兩對引物。該病毒具有傳染性并呈地域流行,主要流行于日本西南部,在我國的福建和廣東的沿海地區(qū)有局部小流行[4],海南地理及氣候環(huán)境與廣東相似,因而海南是否也存在HTLV-1流行引起關(guān)注。

    本研究通過收集海南省三家醫(yī)院病理科診斷為外周T細(xì)胞淋巴瘤的石蠟組織并依據(jù)2008年WHO分類,收集到的46例外周T細(xì)胞淋巴瘤中PTCL-U 20例、NK/T細(xì)胞淋巴瘤11例、CTCL 11例、ATLL 4例。運(yùn)用PCR方法檢測到外周T細(xì)胞淋巴瘤中HTLV-1前病毒陽性8例(占17.39%)與唐秋萍等[5]對海南省無償獻(xiàn)血人群HTLV-I/II血清抗體陽性率(0%)的調(diào)查相比,說明海南省外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生與HTLV-1存在密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中ATLL患者的HTLV-1檢出率高達(dá)75%,進(jìn)一步證實(shí)了HTLV-1與ATLL的發(fā)病密切相關(guān)。CTCL中HTLV-1感染的發(fā)生率各家報(bào)道不一,從0~100%都有[6-9],其相關(guān)性存在爭議,本實(shí)驗(yàn)中CTCL患者的HTLV-1檢出率為10%,與高紅陽等[10]報(bào)道的CTCL中HTLV-1的檢出率(10.5%)相近,說明HTLV-1感染與CTCL的發(fā)病可能存在一定關(guān)系。T/NK及PTCL-U與HTLV-1的關(guān)系國內(nèi)還未見報(bào)道,不過日本曾有研究發(fā)現(xiàn)28例PTCL-U中HTLV-1陽性的6例[2]。

    總之,以上研究結(jié)果表明HTLV-1除與ATLL發(fā)病密切相關(guān)外,與其他類型的T細(xì)胞淋巴瘤也存在一定關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)成功提取外周T細(xì)胞淋巴瘤石蠟包埋組織中HTLV-I的cDNA,以后我們可以充分利用病理科石蠟組織的資源搜集更多的病例,進(jìn)一步研究外周T細(xì)胞淋巴瘤各類型與HTLV-I的關(guān)系,同時(shí),我們打算建立HTLV-1感染的動(dòng)物模型,對其具體的致病機(jī)制做進(jìn)一步研究。

    (廈門大學(xué)熊君輝博士對本實(shí)驗(yàn)給予了無私的幫助,特此致謝!)

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    Primary study of HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.

    FAN Lin-lin1,TAN Shun1*,RAO Xiang1, ZHANG Ying-ai2,WANG Shi-hua3.
    Department of Pathology1,Central Laboratory2,the Affiliated Haikou Hospital of Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;3.Department of Pathology, Hospital of Agricultural Reclamation of Sanya City,Sanya 572000,Hainan,CHINA

    Objective To study the relationship between Human T cell leukemia virus type-1(HTLV-1) and peripheral T cell lymphoma(PTCL)by detecting the HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.MethodsForty-six samples of PTCL were classified according to World Health Organization classification(2008). Genomic DNA extracted from PTCL was detected by PCR for previous DNA of HTLV-1.ResultsEight of the 46 samples showed positive results in the detection of HTLV-1.The detection rate of HTLV-1 was 3/20,1/12,1/10,and 3/4 for peripheral T cell lymphoma-unspecified(PTCL-U),NK/T cell lymphoma,cutaneous T-cell lymphoma(CTCL),and adult T-cell lymphoma(ATLL),respectively.ConclusionHTLV-1 infection is found in patients with PTCL.HTLV-1 may be related to other type of peripheral T cell lymphoma besidesATLL.

    Peripheral T cell lymphoma;HTLV-1;Paraffin-embeded tissues

    R37

    A

    1003—6350(2012)13—001—03

    10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.001

    2012-02-13)

    海南省自然科學(xué)基金(編號:808240)

    凡琳琳(1986-),女山東省菏澤市人,醫(yī)師,碩士。

    談 順。E-mail:tsc116@163.com

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