黃潤蕓,陳 凱,崔清華,李慧芬,張曉平,田景振
(山東中醫(yī)藥大學,山東 濟南 250355)
板藍根(Radix Isatidis)是十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根,具有清熱解毒、涼血利咽的功效,臨床上主要用于溫熱病熱毒入于營血及溫熱病初起或外感風熱諸癥[1]。有研究表明板藍根中總生物堿是其抗病毒有效物質(zhì)[2],目前板藍根總生物堿的含量測定方法尚未見文獻報道,本實驗采用酸性染料比色法建立板藍根總生物堿含量測定方法,并進行方法學考察,可以滿足板藍根總生物堿含量測定的需要。
1.1 儀器 UV-2010型紫外可見分光光度計(日立公司)。
1.2 試藥 4-(3H)-喹唑啉(Sigma公司,批號:20100521),磷酸二氫鉀(分析純,天津科密歐,批號:20071126),溴麝香草酚藍(分析純,天津科密歐,批號:20041024),732離子交換樹脂(國藥集團化學試劑,批號:10024260),蒸餾水,其他試劑均為化學純。
2.1 溶液的制備
2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取4(3H)-喹唑啉對照品10.0 mg,置100 mL容量瓶中,1%鹽酸乙醇溶液溶解并定容,搖勻,作為對照品溶液(每1 mL含4(3H)-喹唑啉1 mg)。
2.1.2 供試品溶液的制備 稱取板藍根最粗粉20 g,加入一定量的80%乙醇水溶液,浸泡36 h,裝入滲漉筒中(3×10 cm)。用15倍量80%乙醇水溶液滲漉提取,流速控制為1 mL·min-1。收集滲漉液,回收溶劑至近干,用80%乙醇溶液溶解并定容至50 mL容量瓶中,作為供試品溶液。
2.2 不同pH值緩沖溶液的制備
2.2.1 pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制 稱取醋酸鈉18 g,加冰醋酸9.8 mL,溶解后再加水稀釋至1000 mL,即得。
2.2.2 pH 5.0 磷酸鹽緩沖液的配制 取 0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液一定量,用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0,即得。
2.2.3 pH 6.0醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制 稱取醋酸鈉54.6 g,加 1 moL·L-1醋酸溶液 20 mL,溶解后加水稀釋至500 mL,即得。
2.2.4 pH 6.8磷酸二氫鉀緩沖液的配制 取 0.2 moL·L-1磷酸二氫鉀溶液 250 mL,加 0.2 moL·L-1NaOH 118 mL,用水稀釋至1000 mL,即得。
2.2.5 pH 7.6磷酸二氫鉀緩沖液的配制 稱取磷酸二氫鉀27.22 g,加水使溶解成 1000 mL,取50 mL 加0.2 moL·L-1NaOH溶液42.4 mL,再加水稀釋至200 mL,即得。
2.2.6 溴麝香草酚蘭溶液的配制 精密稱取溴麝香草酚蘭0.0300 g,溶于1 moL·L-1NaOH 溶液0.5 mL 中,加水稀釋并定容至100 mL容量瓶中。
2.3 檢測波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1 mL置分液漏斗中,加入5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和5 mL溴麝香草酚蘭溶液,搖勻,用40 mL三氯甲烷分4次萃取,每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中。以三氯甲烷作空白掃描紫外全波長圖譜(酸性染料緩沖液不做空白,因其在該波長處紫外吸收無干擾)。二者在417.5 nm處均有最大吸收,故選擇檢測波長為417.5 nm。
圖1 對照品溶液全波長掃描圖 圖2 供試品溶液全波長掃描圖
2.4 含量測定方法相關條件單因素考察研究
2.4.1 不同pH值緩沖液考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份置分液漏斗,分別加入5 mL 2.2項下不同pH值為:4.76、5.20、6.10、6.75、7.62 的緩沖液,再加入5 mL 0.03 g·(100 mL)-1溴麝香草酚蘭溶液,搖勻,用40 mL三氯甲烷分4次萃取,每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中,以三氯甲烷作空白,于417.5 nm處測吸光度。測得吸光度分別為:0.348、0.450、0.640、0.216、0.018。由此選擇緩沖液pH值為:6.10。
2.4.2 酸性染料用量考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份置分液漏斗中,分別加入5 mL pH 6.0醋酸-醋酸鈉緩沖液,再分別加入1、2、3、4、5、6 mL 0.03 g·(100 mL)-1溴麝香草酚蘭溶液,其余操作同2.4.1 項下。測的吸光度分別為:0.146、0.261、0.506、0.564、0.690、0.678。由此選擇酸性染料用量為5 mL。
2.4.3 緩沖液用量的考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份至分液漏斗,分別加入 3、4、5、6、7 mL pH 6.0 醋酸 - 醋酸鈉緩沖液,再分別加入5 mL 0.03 g·(100 mL)-1溴麝香草酚蘭溶液,其余操作同 2.4.1項下。測得吸光度分別為:0.716、0.735、0.752、0.736、0.727。由此選擇緩沖液用量為5 mL。
2.4.4 三氯甲烷萃取液用量考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份至分液漏斗,分別加入5 mL pH 6.0醋酸-醋酸鈉緩沖液,再分別加入5 mL 0.03 g·(100 mL)-1溴麝香草酚蘭溶液,搖勻,分別用三氯甲烷萃取1、2、3、4、5 次,每次10 mL。其余操作同 2.4.1 項下。測得吸光度分別為:0.465、0.592、0.678、0.691、0.696。由此選擇三氯甲烷萃取4 次,每次10 mL。
綜上所述,選擇pH 6.0醋酸-醋酸鈉緩沖液溶液,緩沖液用量為5 mL,溴麝香草酚蘭溶液用量為5 mL,三氯甲烷萃取4次,每次10 mL。
2.5 線性關系的考察 精密吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對照品溶液,加5 mL pH 6.0醋酸-醋酸鈉緩沖液,加入5 mL 0.03 g·(100 mL)-1溴麝香草酚蘭溶液,搖勻,用三氯甲烷萃取4次,每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中,以三氯甲烷作空白,于417.5 nm處測吸光度,由實驗結果得線性回歸方程為:Y=0.023X+0.222,r=0.9999。說明4(3H)- 喹唑啉在 4 ~24 μg· mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。
2.6 精密度實驗 從同一批次供試品溶液中精密吸取0.5 mL溶液6份,按2.4項下方法處理并測定吸光度,RSD=0.16%,表明儀器精密度良好。
2.7 重復性試驗 精密稱取板藍根粉末6份,各1.0g,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,取供試品溶液0.5 mL,置于分液漏斗中,按“2.4”項下方法操作,于 417.5 nm處依法測定吸光度,計算其平均含量為23.20%,RSD為0.14%。表明該方法重現(xiàn)性良好。
2.8 穩(wěn)定性實驗 從供試品溶液中精密吸取0.5 mL溶液,按2.4項下方法處理并測定吸光度,從第一次測A開始計時,分別測定0、15、30、45、60、90、120 min 后的吸光度,樣品2 h內(nèi)顏色無明顯變化,吸光度RSD=1.04%,表明供試品溶液在120 min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。
2.9 加樣回收試驗 從已知濃度的供試品中精取0.5 mL溶液6份,分別加入0.2 mL對照品溶液,按2.4項下方法處理并測定吸光度,計算加樣回收率(n=6),平均回收率為100.3%,RSD=2.17%。
從3批板藍根中各取20 g,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,精密吸取0.5 mL,按2.4項下方法測定總生物堿含量,每批次測3次取平均值,3批藥材中總生物堿含量分別為:5.81%、5.79%、5.83%,RSD=0.34%。
在實驗過程中發(fā)現(xiàn)溴麝香酚藍顯色劑放置一段時間后會不穩(wěn)定,因此顯色劑應現(xiàn)用現(xiàn)配,從而保證測定結果的準確性。此外,嚴禁在三氯甲烷萃取液中混入水分,否則會使溶液變渾濁,影響比色結果。所以在測定吸光度前,必須用脫水劑(如無水硫酸鈉)除去萃取溶劑中的水分。有研究表明板藍根抗病毒物質(zhì)基礎是總生物堿,而2010版《中國藥典》中僅對(R,S)-告依春(C5H7NOS)含量做明確要求,故筆者認為對總生物堿的含量測定考察有相當?shù)囊饬x??偵飰A的含量測定方法有酸堿中和滴定法和酸性染料比色法,兩種方法相比較而言,前者的含量測定結果誤差較大[3],而后者準確性較好,靈敏度更高,重現(xiàn)性好。本實驗建立了酸性染料比色法測定板藍根總生物堿含量,適用于板藍根總生物堿的含量測定。
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:191.
[2]ELLiott MC.Compands from isatis indigotica[J].Phytochemistry,1970,9:1629.
[3]劉喜綱,劉翠哲,常金花.應用酸性染料比色法測定總生物堿的含量[J].中國藥房,2007,18(11):875 -876.