螺旋藻粉β－胡蘿卜素含量測定方法的優(yōu)化*

趙 楠，李勇勇，邵明飛，郁章玉，3，秦 松

(1.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東 曲阜 273165;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095;3.菏澤學(xué)院化學(xué)與化工系，山東 菏澤 274015;4.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所生物資源實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264003)

螺旋藻是絲狀的多細(xì)胞藍(lán)藻，具有很高的藥用及營養(yǎng)價值，被聯(lián)合國糧油組織推薦為“21世紀(jì)最優(yōu)秀的食品”.螺旋藻中β－胡蘿卜素的含量非常豐富，所含的 β－胡蘿卜素達(dá) 1 700 mg/kg(干重)［1］.β－胡蘿卜素是維生素A的前體物質(zhì)，大量研究證實(shí)β－胡蘿卜素是有效的抗氧化劑，能消除人體中的活性氧，消除自由基，在防癌［2］抗癌［3］、預(yù)防心血管疾病，增強(qiáng)免疫功能［4］等方面有明顯作用［5］.螺旋藻粉中的β－胡蘿卜素含量為所有食物之冠，比胡蘿卜中的β－胡蘿卜素含量還要高出10倍［6］.β－胡蘿卜素作為螺旋藻綜合開發(fā)利用的一種功能因子，有很大的商業(yè)化前景.因此，有關(guān)螺旋藻中β－胡蘿卜素成分的研究和測定方法倍受重視.目前常用的測定β－胡蘿卜素含量的方法有紙層析法、分光光度法和高效液相色譜法［7，8］.由于高效液相色譜法樣品的前處理較為麻煩且所需儀器昂貴，所以還未能廣泛普及.而紙層析法步驟比較繁瑣，故本文采用分光光度法進(jìn)行螺旋藻粉β－胡蘿卜素含量的測定，并對該方法操作條件進(jìn)行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 材料

螺旋藻粉，2011年12月份購于廣西，置于陰涼抽屜中避光保存.

1.2 試劑與儀器

儀器:恒溫水浴鍋，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;TU－1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司產(chǎn)品;50 mL具塞比色管，分液漏斗等.

試劑:標(biāo)準(zhǔn)β－胡蘿卜素(Sigma公司產(chǎn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%)，無水硫酸鈉、正庚烷、丙酮、無水乙醇、甲苯、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、石油醚均為國產(chǎn)分析純.

1.3 β－胡蘿卜素最大吸收波長的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［5］

取一定量的β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，溶解在石油醚中，在波長300～600 nm范圍內(nèi)，用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行波譜掃描，得到 β－胡蘿卜素的特征吸收峰，作為β－胡蘿卜素的測定波長.

準(zhǔn)確稱取2.50 mg β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于石油醚，并定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成25 ug/mL的β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于 5 個 10 mL 棕色容量瓶中，用石油醚定容，以石油醚為參比溶液，在450 nm處測定各樣品的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4 樣品的測定

準(zhǔn)確稱取0.2 g左右的螺旋藻藻粉于50 mL的比色管中，加入30 mL提取劑和1 mL質(zhì)量濃度為400 g/L的KOH溶液，混合均勻;比色管放于35℃恒溫水浴中浸泡12 h后，將浸泡液過濾，濾液倒入內(nèi)盛50 mL的20 g/L硫酸鈉溶液的250 mL分液漏斗中，用10 mL提取劑沖洗濾渣，重復(fù)兩次，將洗液、過濾液收集到分液漏斗中.向分液漏斗中加入30 mL乙醚及100 mL蒸餾水，振搖后靜置分層，棄去下層溶液，上層溶液再重復(fù)萃取兩次.萃取所得上層溶液通過一裝有10 g無水硫酸鈉的小漏斗濾入100 mL棕色容量瓶中，用少量石油醚洗滌分液漏斗，并洗去無水硫酸鈉表面的色素，定容至刻度線，搖勻，用分光光度計(jì)測定其在450 nm處的吸光度.

1.5 提取劑

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉后，再分別加入30 mL下列溶液:V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(無水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7;V(石油醚)∶V(丙酮)=1∶1;V(甲醇)∶V(石油醚)=2∶1;乙酸乙酯;V(石油醚)∶V(丙酮)=4∶1;V(丙酮)∶V(氯仿)=1∶2;V(丙酮)∶V(甲醇)=7∶2;石油醚.其余步驟按1.4所述步驟進(jìn)行操作.

1.6 浸提溫度

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉、30 mL 最佳提取劑后，分別于 25，35，45，55，65，75℃恒溫水浴中浸泡12 h，其余步驟按1.4所述步驟進(jìn)行操作.

1.7 提取劑體積

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉后，再分別加入 15，20，25，30，35，40 mL 最佳提取劑，于最佳浸提溫度恒溫水浴中浸泡12 h，其余步驟按1.4所述步驟進(jìn)行操作.

1.8 浸提時間

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉、最佳提取劑體積的提取劑后，于最佳溫度恒溫水浴中，分別密封避光浸泡 2，4，6，8，10，12 h，其余步驟按1.4所述步驟進(jìn)行操作.

1.9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(33)正交試驗(yàn)表，以 V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(無水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7為提取劑，選取浸提溫度、提取劑體積、浸提時間3個因素，每個因素取3個水平，其因素水平見表1.

表1 L9(33)正交試驗(yàn)的因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 β－胡蘿卜素的吸收光譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

β－胡蘿卜素的吸收光譜，如圖1所示.從圖1可見，β－胡蘿卜素在波長300～600 nm范圍內(nèi)有兩處較大的吸收峰，其中在450 nm處吸收峰值最大，是β－胡蘿卜素的特征吸收峰，本試驗(yàn)選擇450 nm作為β－胡蘿卜素的測定波長.

圖1 β－胡蘿卜素光譜掃描曲線

β－胡蘿卜素的質(zhì)量濃度(ρ)在0～2.5 ug/mL范圍內(nèi)與吸光度值(A)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，如圖2所示.其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:A=0.308 9ρ－0.008 8，r2=0.999 5.

圖2 β－胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取劑對β－胡蘿卜素含量測定的影響

各提取劑對β－胡蘿卜素含量測定的影響見表2.由表2知，V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(無水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7為最佳提取劑，其提取到的β－胡蘿卜素含量測定最高，以下實(shí)驗(yàn)中均以此為提取劑.

表2 提取劑對β－胡蘿卜素含量測定的影響

2.3 浸提溫度對β－胡蘿卜素含量測定的影響

隨著浸提溫度的升高，β－胡蘿卜素的測定含量呈先增大后減小的趨勢，見表3.當(dāng)恒溫水浴溫度為35℃時，β－胡蘿卜素測定的含量最大，為134.15 mg/100g.此后隨著恒溫水浴溫度的升高，β－胡蘿卜素的測定含量開始平緩地減小.這表明適當(dāng)?shù)靥岣呓釡囟瓤商岣擀拢}卜素的測定含量，過高的溫度可能會影響β－胡蘿卜素的穩(wěn)定性，可能會使β－胡蘿卜素發(fā)生降解而被破壞，使得β－胡蘿卜素的測定含量較低.

表3 浸提溫度對β－胡蘿卜素含量測定的影響

2.4 提取劑體積對β－胡蘿卜素含量測定的影響

當(dāng)提取劑體積為30 mL時，提取效果較好，此時提取物中的β－胡蘿卜素的測定含量達(dá)到最高值，見表4.試驗(yàn)表明，提取劑的體積過大或過小，都不利于β－胡蘿卜素的提取，因此30 mL為最佳提取劑體積.

表4 提取劑體積對β－胡蘿卜素含量測定的影響

2.5 浸提時間對β－胡蘿卜素含量測定的影響

當(dāng)浸提時間為12 h時，浸提效果最好，此時提取物中的β－胡蘿卜素測定含量達(dá)到最高值為134.15 mg/100 g，見表5.浸提時間過短，不利于β－胡蘿卜素的充分溶出.隨著浸提時間的延長，β－胡蘿卜素測定含量逐漸增大.

表5 浸提時間對β－胡蘿卜素含量測定的影響

2.6 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

β－胡蘿卜素含量測定的正交試驗(yàn)結(jié)果見表6.由表6可知，影響β－胡蘿卜素含量測定的因素依次為:浸提溫度＞提取劑體積＞浸提時間，最佳提取工藝為A2B2C3，即以V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(無水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7為提取劑，提取劑體積為30 mL，浸提時間為12 h，浸提溫度為35℃.

表6 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

3 討論與結(jié)論

1)β－胡蘿卜素易被氧化，見光易分解，故本試驗(yàn)須在遮光條件下進(jìn)行.樣品在提取過程中，遮光條件下浸泡12 h，在一定程度上減少了β－胡蘿卜素的損失，從而提高了β－胡蘿卜素的測定含量.

2)通過正交試驗(yàn)得出，提取β－胡蘿卜素的最佳工藝條件為:V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(無水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7為提取劑，提取劑體積為30 mL，35℃下浸提12 h;在最佳工藝條件下β－胡蘿卜素的測定含量為134.5 mg/100 g.

3)本試驗(yàn)方法簡單，實(shí)驗(yàn)所需儀器均較為普通，便于企業(yè)生產(chǎn)過程對β－胡蘿卜素進(jìn)行快速檢測及監(jiān)控.

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