葡萄糖酸替代飼用抗生素對黃羽肉雞免疫器官指數(shù)及小腸黏膜免疫的影響

新 疆 農(nóng) 業(yè) 大 學 李 虎 李海英 崔 彪

新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實驗室 翟衛(wèi)爽 李曉斌 楊開倫＊

葡萄糖酸是葡萄糖在葡萄糖桿菌的作用下發(fā)生不完全氧化的產(chǎn)物。葡萄糖酸很難被單胃動物小腸吸收，因此，其能順利到達腸后段，發(fā)酵最終產(chǎn)生丁酸（Deppen meier等，2002；Tsuka-hara 等，1994）。丁酸是大腸上皮細胞主要能量的來源（Roediger，1980）。因此，葡萄糖酸可以間接刺激腸后段上皮細胞的生長（Biagi等，2006）。研究表明，葡萄糖酸在生產(chǎn)性能和屠宰性能指標方面可以替代黃羽肉雞飼用抗生素，但作用機制仍不清楚（許蕓等，2011）。本試驗旨在研究基礎(chǔ)日糧中添加不同水平的葡萄糖酸替代飼用抗生素對黃羽肉雞免疫器官指數(shù)、小腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量、十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量、小腸內(nèi)容物中細菌數(shù)量及回腸內(nèi)容物中有機酸濃度的影響，為葡萄糖酸替代肉雞飼用抗生素提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 將180只1日齡體重相近的健康黃羽肉雞隨機分為5個處理組，每個處理3個重復，每個重復12只雞。陰性對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，陽性對照組在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加0.3 g/kg那西肽和0.25 g/kg硫酸粘桿菌素，試驗I、II、III組分別在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加1、2、3 g/kg葡萄糖酸。試驗雞在籠上公母混養(yǎng)，按常規(guī)免疫和飼養(yǎng)管理。分別在45 d和77 d，每組選取6只黃羽肉雞采集樣品。

1.2 樣品采集 在45 d和77 d時，每組選取6只試驗雞，進行稱重、采血、頸部放血屠宰，分別摘取胸腺、脾臟、法氏囊并稱重，記錄數(shù)據(jù)，用于計算免疫器官指數(shù)；然后依次剝離十二指腸、空腸、回腸，分別收集各腸段內(nèi)容物，裝入封口袋中用液氮迅速冷凍，于-20℃冰箱保存，用于測定腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量及回腸內(nèi)容物有機酸濃度；各腸段分別用20 mL生理鹽水沖洗，稱重、記錄重量；將各腸段均一分為二，做好記錄、標記；取各腸段的后段裝入封口袋中用液氮冷凍，于-20℃冰箱保存，用于測定腸黏膜蛋白質(zhì)、腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量和十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量。

1.3 樣品制備 黏膜待測液的制備：將冷凍于-20℃冰箱中的各段腸道的后段，于室溫下解凍，稱重并記錄重量；刮取腸黏膜，按黏膜重：體積為1∶2的比例加入0.01 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，4℃冰箱中靜置30 min，懸浮于盛有冷水的超聲波清洗器中超聲5 min，4℃，12000 r/min離心20 min，取上清液于4℃冰箱放置，當天用于測定腸黏膜蛋白質(zhì)含量、腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量和十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量。

細菌數(shù)量測定樣品液的制備：將冷凍于-20℃冰箱中的各腸段腸道內(nèi)容物在室溫下解凍，充分混勻后準確稱取0.1 g左右于10 mL離心管中，加入5 mL滅菌的生理鹽水稀釋，懸浮于盛有冷水的超聲波清洗器中超聲5 min，混勻，靜置5 min進行染色測定。

有機酸測定樣品的制備：充分混勻已解凍的回腸內(nèi)容物，準確稱取0.5 g左右于10 mL離心管中，加入2.0 mL蒸餾水、混勻，懸浮于盛有冷水的超聲波清洗器中超聲15 min，吸取0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL甲醇、混勻，4℃，12000 r/min離心10 min，取上清液于4℃冰箱放置，當天用高效液相色譜儀測定回腸內(nèi)容物中有機酸的濃度。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 免疫器官指數(shù)測定 免疫器官指數(shù)用采集樣品時記錄的試驗雞體重、胸腺重、脾臟重、法氏囊重計算，用免疫器官的重量（g）與屠宰前試驗雞活重（kg）的比值表示。

1.4.2 小腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量測定 本試驗條件下，一個FTP溶菌酶單位定義為：在規(guī)定條件下于450 nm處每分鐘使吸光度降低0.001時所需的酶量。在一定濃度的渾濁菌液中，由于溶菌酶水解細胞壁粘多糖使細菌裂解濃度降低，透光度增強，故可以根據(jù)濁度變化來推測溶菌酶的含量。

對照管、測試管中分別加入2.5 mL的溶壁微球菌懸浮液（2.5 g/L），空白管中加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液（1/15 mol/L，pH 6.2），均在 37 ℃電熱恒溫水浴箱中保溫5 min，對照管加入0.02 mL的蒸餾水，測試管、空白管分別加入0.02 mL的待測樣品液，均在37℃電熱恒溫水浴箱中反應(yīng)2 min，分別加入0.15 mL氫氧化鉀溶液（5 mol/L）終止反應(yīng)，于450 nm波長處測定吸光度值。為了消除待測樣品溶液顏色和濁度對試驗結(jié)果的影響，本試驗隨機選取了12個待測樣品溶液測得的樣品空白OD值為0.4248，變異系數(shù)為1.52%，蒸餾水12次重復測得的水空白OD值為0.4080，變異系數(shù)為1.21%，均小于5%，故本試驗中樣品空白值取0.4248，水空白值取0.4080。吸光度變化值△OD=（對照管的OD值－水空白管OD值）－（測試管OD值－樣品空白管OD值），本試驗條件下，溶菌酶濃度的線性范圍為0～100 μg/mL，線性關(guān)系為Y=310.8X+0.37（Y表示溶菌酶濃度，X表示吸光度變化值，R2=0.9994）。用100mg腸黏膜蛋白中含比活力為70000 U/mg的溶菌酶微克數(shù)表示小腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量。

1.4.3 十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量測定用上海華壹生物科技有限公司生產(chǎn)的雞分泌型免疫球蛋白A （SIgA）ELISA檢測試劑盒于450 nm處測定，嚴格按試劑盒使用說明書進行操作。十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量，用100 mg腸黏膜蛋白質(zhì)中含SIgA的毫克數(shù)表示。腸黏膜中蛋白質(zhì)含量用Brandford法測定，用1 g腸黏膜中含蛋白質(zhì)的毫克數(shù)表示（Brandford，1976）。

1.4.4 腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量測定 細菌數(shù)量測定用帶有萬能視頻成像裝置的生物顯微鏡測定。結(jié)果以1 g內(nèi)容物中細菌數(shù)量（N）的對數(shù)值（lgN）表示。

1.4.5 回腸內(nèi)容物中有機酸濃度測定 回腸內(nèi)容物中有機酸的濃度用高效液相色譜儀測定。色譜條件：流動相 A∶甲醇（色譜純），流動相 B：50 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.7）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：214 nm；洗脫方式：二元梯度洗脫。結(jié)果以1L回腸內(nèi)容物溶液中含有機酸的毫摩爾數(shù)表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗數(shù)據(jù)以 “平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS16.0軟件ONE-WAY ANOVA進行方差分析，各組平均數(shù)多重比較采用 Duncan’s法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖酸對黃羽肉雞免疫器官指數(shù)的影響由表 1可知，45 d時， 試驗 I、II、III組胸腺重、胸腺指數(shù)、脾臟重、脾臟指數(shù)、法氏囊重、法氏囊指數(shù)均與陽性對照組均無顯著差異（P＞0.05），但脾臟重、脾臟指數(shù)均略高于陽性對照組（P＞0.05），而低于陰性對照組（P ＞ 0.05）。77 d 時，試驗 I、II、III組胸腺重比陽性對照組分別降低19.34%（P＞0.05）、58.29%（P ＜ 0.01）、43.78%（P ＜ 0.05）；除試驗I組，II、III組胸腺重略低于陰性對照組（P＞0.05）； 試驗 I、II、III組胸腺指數(shù)比陽性對照組分別降低 27.34%（P ＞ 0.05）、63.08%（P ＜ 0.01）、48.83%（P ＜ 0.01）， 除試驗 I組外，II、III組胸腺重略低于陰性對照組（P ＞ 0.05）；試驗 I、II、III組脾臟重、脾臟指數(shù)、法氏囊重、法氏囊指數(shù)與陽性對照組和陰性對照組均無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 葡萄糖酸對黃羽肉雞腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶和SIgA含量的影響 由表2可知，除陽性對照組外，其余各組黃羽肉雞小腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量隨著日齡的增加均呈上升趨勢。45 d時，試驗I、II、III組十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量比陽性對照組分別降低60.54%（P＜0.01）、41.80%（P ＜ 0.01）、38.47%（P ＜ 0.01），比陰性對照組分別降低 53.65%（P＜0.01）、31.63%（P ＜ 0.01）、27.72%（P ＜ 0.01）；試驗 I、II組空腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量比陽性對照組分別降低 56.70%（P ＜ 0.01）、27.09%（P ＜ 0.05），試驗II、III組與陰性對照組均差異不顯著 （P＞0.05）；試驗I、II、III組回腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量均極顯著低于陽性對照組和陰性對照組 （P＜0.01），3個試驗組之間差異均不顯著 （P＞0.05）。77 d時，試驗I、II、III組十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量均高于陽性對照組（P＞0.05），均低于陰性對照組（P ＞ 0.05）；試驗 I、II、III組空腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量均高于陽性對照組 （P＞0.05）和陰性對照組（P ＞ 0.05）；試驗 I、II、III組回腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量均高于陽性對照組（P＞0.05）， 試驗I、II組均高于陰性對照組 （P＞0.05）。 結(jié)果表明，45 d 時，試驗 I、II、III組黃羽肉雞腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量均低于陽性對照組和陰性對照組；77 d時，試驗 I、II、III組黃羽肉雞十二指腸、空腸、回腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量均高于陽性對照組。

45 d時，試驗I、II、III組十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量比陽性對照組分別提高228.69%（P ＜ 0.01）、207.49（P ＜ 0.01）、227.84（P ＜ 0.01），比陰性對照組分別提高 246.50%（P＜0.01）、224.15（P ＜ 0.01）、245.60（P ＜ 0.01）。 77 d 時，試驗I、II組十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA的含量均顯著高于陽性對照組和陰性對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素提高了黃羽肉雞十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA的含量。

2.3 葡萄糖酸對黃羽肉雞腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量的影響 由表 3可知，45 d時，試驗 I、II、III組黃羽肉雞十二指腸內(nèi)容物中細菌數(shù)量比陽性對照組 分 別 提 高 0.20%（P ＞ 0.05）、1.38%（P ＜0.01）、1.28%（P ＜ 0.05），比陰性對照組略低（P ＞0.05）；空腸內(nèi)容物細菌數(shù)量比陽性對照組分別提高-0.77%（P ＞ 0.05）、-0.19%（P ＞ 0.05）、0.97%（P＜0.05），比陰性對照組分別提高-0.58%（P＞0.05）、0.00%（P ＞ 0.05）、1.16%（P ＜ 0.05）；回腸內(nèi)容物中細菌數(shù)比陽性對照組分別提高0.58%（P ＞ 0.05）、0.68%（P ＞ 0.05）、0.58%（P ＞ 0.05），比陰性對照組略低（P ＞ 0.05）。77 d 時，試驗 I、II、III組黃羽肉雞十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物細菌數(shù)量大多高于陽性對照組（P＞0.05），大多低于陰性對照組（P＞0.05）。結(jié)果表明，在黃羽肉雞基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素能夠減少黃羽肉雞腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量，作用效果不及飼用抗生素。

表2 葡萄糖酸對黃羽肉雞腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶和SIgA含量的影響

表3 葡萄糖酸對黃羽肉雞腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量的影響 lgN/g

2.4 葡萄糖酸對黃羽肉雞回腸內(nèi)容物中有機酸濃度的影響 由表 4可知，試驗 I、II、III組 77 d黃羽肉雞回腸內(nèi)容物中蘋果酸、乙酸、檸檬酸、總酸濃度均低于陽性對照組（P＞0.05），乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、總酸濃度均高于陰性對照組（P＞0.05）；乳酸濃度比陽性對照組分別提高 14.61%（P＞0.05）、43.40%（P ＞ 0.05）、40.99%（P ＞ 0.05）， 比陰性對照組分別降低 33.22%（P＞0.05）、16.45%（P ＞ 0.05）、17.85%（P ＞ 0.05）； 乙酸濃度比陽性對照組分別降低23.77%（P＞0.05）、34.42%（P ＜ 0.05）、14.07%（P ＞ 0.05），比陰性對照組分別提高67.73%（P＜0.05）、44.30 %（P ＞ 0.05）、89.08%（P ＜ 0.05）；檸檬酸濃度比陽性對照組分別降低37.93%（P＜ 0.05）、50.00%（P ＜ 0.01）、67.82%（P ＜0.01），比陰性對照組分別提高 111.76%（P＞ 0.05）、70.59%（P ＞ 0.05）、9.80%（P ＞0.05）；總酸濃度比陽性對照組分別降低17.54%（P ＞ 0.05）、24.37%（P ＞ 0.05）、7.83%（P＞0.05），比陰性對照組分別提高27.25%（P ＞ 0.05）、16.72% （P ＞ 0.05）、42.24%（P＞0.05）。結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素提高了77 d黃羽肉雞回腸內(nèi)容物乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸及總酸的濃度。

3 討論

3.1 葡萄糖酸對黃羽肉雞免疫器官的影響 動物免疫功能的高低取決于免疫器官的發(fā)育狀態(tài)及機能強弱。胸腺、脾臟、法氏囊的重量可用于評價雛雞的免疫狀態(tài)，一般認為免疫器官重量的降低為免疫抑制所致，反之則為免疫增強、生長發(fā)育快的表現(xiàn)，免疫器官的生長發(fā)育和迅速成熟，可使肉仔雞的整體免疫機能加強，抵抗各種病原微生物感染的能力和抗各種應(yīng)激的能力得到提高 （程相朝等，2002；Rivos，1988）。 本試驗結(jié)果表明，與陰性對照組相比，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代肉雞飼用抗生素降低了黃羽肉雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)，且隨葡萄糖酸添加量的增加呈下降趨勢。45 d試驗I組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)均高于陽性對照組。原因可能是基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素改變了黃羽肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，微生物對免疫系統(tǒng)的刺激減弱，引起免疫器官功能減弱（朱碧泉等，2007；黃小青等，2005）。

表4 葡萄糖酸對黃羽肉雞回腸有機酸的影響mmol/L

3.2 葡萄糖酸對黃羽肉雞小腸黏膜免疫的影響腸道黏膜不僅是消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所，而且還具有重要的免疫功能。溶菌酶作為動物自身的非特異性免疫因子，參與機體多種免疫反應(yīng)，可改善和增強巨噬細胞的吞噬和消化功能，增強機體抵抗力，對維持腸道菌群平衡及促進動物生長具有良好的作用。本試驗結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素明顯降低了45 d黃羽肉雞腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量，而增加了77 d黃羽肉雞腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶的含量。原因可能是添加葡萄糖酸對黃羽肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變導致的。

分泌型免疫球蛋白A（SIgA）是腸道黏膜免疫的主要效應(yīng)分子，是腸上皮抵御毒素和致病微生物侵害的第一道防線，對禽類的黏膜免疫起重要作用（Mantis等，2011）。SIgA 主要功能有，一是抑制腸道內(nèi)的細菌黏附腸道黏膜表面，SIgA在黏膜表面是通過黏膜內(nèi)蠕動和絨毛清除來阻止黏膜與病原體的接觸，SlgA直接阻止或在空間上干涉微生物與介導上皮黏附的蛋白接觸，尤其在上皮細胞泡狀間隙內(nèi)阻止入侵的病原體 （Bomsel等，1998；Lamm，1997；Burns 等 ，1996；Mazanec 等 ，1992；Buke 等，1989；Danielson 等，1989）。 二是中和腸道內(nèi)的毒素、酶和病毒，并結(jié)合抗原形成免疫復合物由吞噬細胞吞噬清除，使已被腸道酶類改變的病原體毒力降低。本試驗結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素提高了黃羽肉雞十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA的含量，表明十二指腸黏膜的主動免疫功能得到加強?；A(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素降低了黃羽肉雞消化道pH，引起消化道內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化引起腸黏膜分泌SIgA的水平發(fā)生變化。

3.3 葡萄糖酸對黃羽肉雞腸道細菌數(shù)量和有機酸濃度的影響 當單胃動物采食的葡萄糖酸很難被小腸吸收，能順利到達腸后段，發(fā)酵最終產(chǎn)生丁酸，丁酸是大腸上皮細胞主要能量的來源，可以間接地刺激腸后段上皮細胞的生長，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收（Biagi等，2006；Tsukahara 等，2002；Asano等，1994；Roediger，1980）。 動物消化道內(nèi)酸性條件有利于乳酸菌的繁殖，且乳酸菌產(chǎn)物-乳酸能阻礙大腸桿菌在腸道內(nèi)與其受體結(jié)合，抑制其生長，促進有益菌增殖。同時，有機酸本身還具有較強的殺菌作用，如延胡索酸對葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等有很強的殺滅活性，而丙酸對沙門氏菌、真菌及革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，乳酸對某些病毒、革蘭氏陰性菌都有一定的殺滅作用（Danielson等，1989）。本試驗結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素提高了77 d黃羽肉雞回腸內(nèi)容物中乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸及總酸的濃度。有機酸的雙重作用，一是為黃羽肉雞腸道黏膜細胞提供營養(yǎng)；二是調(diào)節(jié)腸道微生物種群結(jié)構(gòu)及殺菌作用?；A(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素造成肉雞消化道酸度增加，可能抑制了有害細菌繁殖，導致肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)及內(nèi)容物有機酸濃度發(fā)生變化，從而引起黏膜免疫功能發(fā)生變化。

4 小結(jié)

本試驗條件下，基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖酸替代飼用抗生素提高了十二指腸黏膜蛋白質(zhì)中SIgA含量，增強了十二指腸黏膜主動免疫功能；提高了77 d黃羽肉雞空場、回腸腸黏膜蛋白質(zhì)中溶菌酶含量及回腸內(nèi)容物中乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸及總酸的濃度；對雞免疫器官指數(shù)、小腸內(nèi)容物中細菌總數(shù)總體影響不明顯。因此，葡萄糖酸替代飼用抗生素改善了黃羽肉雞腸黏膜免疫功能。

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