復(fù)合誘變選育高效生物破乳劑產(chǎn)生菌及其特性

劉 暢，楊基先，李 昂，李 旭，馬 放，陸 建

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.中國宜興環(huán)保科技工業(yè)園科技發(fā)展局，214200江蘇宜興)

生物破乳劑的高效性和環(huán)保性是化學(xué)破乳劑無法比擬的.在原油脫水、油污分離、含油廢水處理等領(lǐng)域開發(fā)、應(yīng)用前景十分廣闊［1-6］.目前，生物破乳劑仍處于實驗室研發(fā)階段，無法進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用，其中野生型生物破乳劑產(chǎn)生菌的破乳能力和破乳活性物質(zhì)產(chǎn)量較低成為主要限制因素之一.因此，采用人工誘變或生物改造方法對野生型的生物破乳劑產(chǎn)生菌進(jìn)行改造，提高生物破乳劑的產(chǎn)率及活性，對生物破乳劑的工程化應(yīng)用具有重要意義.

以人工誘變基因突變?yōu)榛A(chǔ)的誘變育種方法，如利用物理(紫外輻射、微波)和化學(xué)(亞硝基胍、亞硝酸等)誘變獲得突變體，已成為發(fā)酵工業(yè)中獲得優(yōu)良高產(chǎn)菌株的主要途徑，也是研究微生物生理代謝機制的主流方法［7-8］.傳統(tǒng)的誘變育種多采用單一的誘變方法，盲目性和隨機性較大，且隨著誘變次數(shù)的增多，菌種的耐受性增強，誘變效率下降.因此，使用多種誘變方法，通過協(xié)同作用進(jìn)行復(fù)合誘變成為誘變育種的一個重要趨勢.為提高生物破乳菌的破乳能力，對生物破乳劑產(chǎn)生菌Bacillus mojavensis XH1進(jìn)行復(fù)合誘變育種研究，篩選高效的破乳劑產(chǎn)生菌突變株，為工業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源.

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 出發(fā)菌株

生物破乳劑產(chǎn)生菌株XH1分離自大慶油田受石油污染的土壤，經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定為芽孢桿菌屬莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)，由本實驗室保藏．

1.1.2 培養(yǎng)基及模型乳狀液的配制

篩選培養(yǎng)基:NH4Cl 4.0 g，K2HPO44.0 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·H2O 0.2 g，微量元素溶液1 mL，液體石蠟4%(體積分?jǐn)?shù))，去離子水1 L，于121℃下滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基:NH4Cl4.0 g，K2HPO44.0 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·H2O 0.2 g，微量元素溶液1 mL，液體石蠟4%(體積分?jǐn)?shù))，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，去離子水1 L，于112℃下滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌.培養(yǎng)條件:XH1菌株種子液置于30℃、140 r/min的搖床中培養(yǎng).

平板培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉20.0 g，葡萄糖5.0 g，去離子水1 L，pH=7.0，于112℃下滅菌20 min.

模型乳狀液的配制方法見文獻(xiàn)［9］.

1.1.3 實驗儀器和設(shè)備

紫外-可見分光光度計:北京普析通用儀器有限公司T6新世紀(jì);低溫高速離心機:SIGMA 2-16PX型;乳化剪切機:FLUKO awdel F6/10.

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變方法

1)紫外誘變.對數(shù)期的XH1菌株離心10 min(5 kr/min)收集菌體制成菌懸液，用生理鹽水洗滌懸浮后的菌懸液放于直距30 cm、20 W紫外燈下照射一定時間后，在紅燈下稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取0.1 mL涂平板30℃光培養(yǎng)，計平板菌落數(shù)，計算致死率，繪制致死曲線并挑出菌落形態(tài)差異明顯的突變菌落繼代培養(yǎng).

2)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)誘變.對數(shù)期的XH1菌株離心10 min(5 kr/min)收集菌體制成菌懸液，用pH 7.0的0.05 mol/L的磷酸緩沖液配制一定質(zhì)量濃度的NTG溶液，取1 mL菌懸液加入9 mL pH 7.0的0.05 mol/L的磷酸緩沖液充分混合，于37℃下震蕩培養(yǎng)30 min后，取2 mL加入10 mL 0.07 mol/L Na2HPO4液中止，稀釋后取0.1 mL涂平板，30℃，計平板菌落數(shù)，計算致死率，繪制致死曲線.

1.2.2 致死率的計算及菌株初篩

致死率/%=［(對照1 mL菌液中的活菌數(shù)-處理后1 mL菌液中的活菌數(shù))/對照1 mL菌液中的活菌液］×100.

紫外誘變以80%左右的致死率確定誘變時間，NTG誘變以70%～80%左右的致死率確定誘變時間后，在平板上隨機挑取直徑較大的單菌落進(jìn)行初篩.

1.2.3 復(fù)篩及破乳劑產(chǎn)生菌破乳性能的測定

復(fù)篩時選取初篩中發(fā)生正突變的菌株，采用液態(tài)發(fā)酵，測定每株菌株發(fā)酵液的破乳能力，并測試其連續(xù)傳代后的破乳能力，考察突變體的遺傳穩(wěn)定性.原始菌株和突變體的破乳率和生物量的測定方法見文獻(xiàn)［9］.

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線輻射后突變株的選擇

通過不同紫外線輻照時間對出發(fā)菌株XH1的致死率和正突變率的雙重影響來確定最佳紫外輻射強度，通過比較突變株與出發(fā)菌株破乳率的高低來計算正變率，結(jié)果見圖1.隨紫外線照射時間的增加，細(xì)菌死亡率也逐漸增加，當(dāng)紫外輻照時間達(dá)2 min時，出發(fā)菌株XH1的死亡率為83.13%，這時細(xì)菌的正突變率相對最大為27.57%，因此，確定紫外線最佳輻射時間為2 min.紫外線誘變篩選突變菌株的過程見文獻(xiàn)［10］，隨機挑取直徑較大的單菌落放入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測試其破乳能力，初選出8株正突變菌株(表1所示)，經(jīng)過連續(xù)傳代后測其破乳能力，考察突變體的遺傳穩(wěn)定性.大多數(shù)突變菌株顯示出不穩(wěn)定的破乳性能遺傳特性，破乳能力都有所下降.綜合對比后篩選出4株破乳能力相對穩(wěn)定的突變株，分別命名為XV2、XV7、XV15和XV26.其中，XV2的12 h和24 h的破乳率分別比原始菌株XH1高出42.4%和12.4%，因此選擇其為下一輪誘變的出發(fā)菌株.

圖1 紫外輻照時間對XH1致死率和正突變率的影響

表1 紫外誘變篩選突變菌株破乳能力的傳代穩(wěn)定性

2.2 紫外線與NTG復(fù)合誘變高效生物破乳劑產(chǎn)生菌突變株的選擇

2.2.1 NTG最佳處理劑量的選擇

超誘變劑亞硝基胍(NTG)能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，在復(fù)制叉附近1個基因突變能誘發(fā)附近位置的基因陸續(xù)連鎖突變［11-12］.以經(jīng)過紫外輻射篩選出的XV2為初發(fā)菌株，經(jīng)NTG質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/L處理20 min后，其致死率和正突變率結(jié)果見圖2.隨著NTG質(zhì)量濃度的增加，菌體死亡率也隨之增加.當(dāng)NTG質(zhì)量濃度為40 mg/L時，菌株XV2的死亡率達(dá)73.64%，正突變率為21.47%，菌體的死亡率較高而且可以保障較高的正突變率，因此，確定NTG的最佳處理質(zhì)量濃度為40 mg/L.

2.2.2 紫外線與NTG復(fù)合處理突變株的選擇

將經(jīng)NTG處理后的菌株XV2的菌懸液接種到篩選培養(yǎng)基中，置于搖床轉(zhuǎn)數(shù)為140 r/min的培養(yǎng)條件下，30℃培養(yǎng)3～5 d后，將菌液梯度稀釋后，均勻涂布于平板培養(yǎng)基中，隨機挑取直徑較大的單菌落放入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測試破乳能力.在大量的突變體中篩選出3株破乳能力明顯高于XV2的突變菌株，分別命名為XN5、XN17和XN23.經(jīng)過連續(xù)的傳代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示XN5的破乳能力比較穩(wěn)定，見表2.XN5的12 h和24 h破乳率分別為94.17%和98.67%，比其出發(fā)菌株XV2分別提高了15.73%和2.42%，比原始菌株XH1提高了64.81%和15.12%.

圖2 NTG質(zhì)量濃度對XV2致死率和正突變率的影響

表2 紫外與NTG復(fù)合誘變篩選突變菌株破乳能力的傳代穩(wěn)定性

2.3 復(fù)合誘變后的菌株XN5與原始菌株XH1破乳性能的對比

在碳源為葡萄糖10 g/L和液體石蠟的混合碳源，其中液體石蠟投加量為4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，氮源為NH4Cl 4.0 g/L與酵母膏的混合氮源，其中酵母膏投加量為1.0 g/L，溫度30℃，初始pH=6.5，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為140 r/min的培養(yǎng)條件下，探討了突變體XN5和原始菌株XH1生長曲線的對比和不同培養(yǎng)時間破乳率的變化(圖3、4所示).通過對比發(fā)現(xiàn)突變株和原始菌株的生長曲線沒有明顯區(qū)別，都在14～26 h時處于對數(shù)生長期，26 h以后進(jìn)入了穩(wěn)定期和衰亡期，但是單位體積發(fā)酵液中的生物量，突變菌株與原始菌株相比有所提高.培養(yǎng)時間在14～24 h時，突變株和原始菌株都具有較高的破乳活性，而且突變菌株的破乳能力明顯優(yōu)于原始菌株，突變菌株的破乳速率也明顯高于原始菌株，當(dāng)培養(yǎng)時間為20 h時，突變菌株12 h的破乳率比原始菌株提高了64.81%.

圖3 突變體XN5和原始菌株XH1的生長曲線對比

圖4 突變體XN5和原始菌株XH1不同培養(yǎng)時間破乳率對比

3 結(jié)論

1)紫外和亞硝基胍具有很好的協(xié)同作用，利用二者復(fù)合處理誘變對象，使誘變產(chǎn)生的突變體后代遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，在世代分離選擇中通過優(yōu)良基因的重組和累加，可獲得較高的正突變率，是生物破乳劑產(chǎn)生菌誘變育種的一種好方法.

2)生物破乳劑產(chǎn)生菌Bacillus mojavensis XH1在采用紫外和亞硝基胍(NTG)復(fù)合誘變后篩選出了一株遺傳特性穩(wěn)定、破乳性能更高的突變體XN5.突變株XN5的12 h和24 h破乳率分別為94.17%和98.67%，比原始菌株XH1提高了64.81%和15.12%.

3)在最佳培養(yǎng)條件下，突變菌株XN5和出發(fā)菌株XH1的生長曲線基本一致;在不同的培養(yǎng)時間下，突變菌株的12 h和24 h破乳率比原始菌株XH1分別提高了35.91%～38.53%和10.6%～13.95%.

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