腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子拮抗β淀粉樣蛋白所致大鼠在體海馬長時(shí)程增強(qiáng)的傷害*

李清山,楊 威,潘艷芳,閔 婕,張 吉吉,高慧中,祁金順△

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,2.山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系、細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原030001;3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100005)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病。據(jù)《世界阿爾茨海默病報(bào)告》(World Alzheimer Report)統(tǒng)計(jì),2010年全球約有3560萬AD患者[1]。AD的典型病理特征之一是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑,其主要成分是由39～43個(gè)氨基酸組成的β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)。目前,Aβ的神經(jīng)毒性已被廣泛報(bào)道[2]。長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)是突觸前神經(jīng)元受到快速重復(fù)性刺激后出現(xiàn)的突觸后反應(yīng)持續(xù)性增強(qiáng)現(xiàn)象,海馬LTP已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是理想的反映突觸可塑性的功能性指標(biāo)和學(xué)習(xí)記憶電生理細(xì)胞模型。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種,其主要分布在海馬、大腦皮層和紋狀體等部位[3]。Phillips HS等[4]1991年已證實(shí),AD患者海馬內(nèi)存在著大量的老年斑,同時(shí)海馬內(nèi)的BDNF和BDNF mRNA的含量有明顯降低。以后,陸續(xù)有報(bào)道表明,BDNF能保護(hù)大鼠免受應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)記憶傷害[5];BDNF對(duì)AD模型小鼠行為學(xué)也有明顯的保護(hù)作用[6]。近年來,Zheng Z等人[7]的實(shí)驗(yàn)表明,Aβ還能抑制BDNF的表達(dá) 。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,BDNF可能參與AD時(shí)的神經(jīng)元變性及其代償機(jī)制。然而,保護(hù)海馬LTP免受Aβ傷害的研究仍然十分有限;BDNF對(duì)AD動(dòng)物行為學(xué)保護(hù)作用的電生理機(jī)制還不清楚;BDNF是否影響海馬突觸傳遞及其可塑性,是否能夠阻止Aβ引起的海馬LTP損傷尚未見系統(tǒng)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過記錄在體大鼠海馬CA1區(qū)場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potentials,fEPSPs)和反映突觸可塑性的LTP,研究了BDNF拮抗Aβ的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng),旨在為AD的預(yù)防和治療尋找新的、有效的腦內(nèi)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

健康雄性SD大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重250～ 300 g。Aβ25-35(Sigma公司)和BDNF(北京愛迪博生物科技有限公司),均用生理鹽水溶解。36只大鼠隨機(jī)分為六組(n=6):分別為對(duì)照組 、2 nmol Aβ25-35組 、0.1 μ g BDNF 組 、0.02 μ g BDNF+Aβ25-35組 、0.1 μ g BDNF+Aβ25-35組和 0.5 μ g BDNF+Aβ25-35組。每組給藥體積均為 2 μ l,對(duì)照組給予2 μ l的生理鹽水。

1.2 手術(shù)及電極定位

25%烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉大鼠。在雙臂數(shù)字式腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào):68004)上固定大鼠,暴露顱骨,以前囟點(diǎn)(Bregma)為基準(zhǔn)鉆孔。在腦立體定位儀和微推進(jìn)裝置引導(dǎo)下,將自制的不銹鋼給藥導(dǎo)管插入左側(cè)海馬CA1區(qū)中心部位(Bregma后2.8mm,中線旁開2.0 mm,深度3.0 mm);將自行設(shè)計(jì)的平行綁定電極同步垂直插入大鼠左側(cè)海馬部位,其中刺激電極和記錄電極尖端分別定位于海馬Schaffer側(cè)支(Bregma后4.2 mm,中線旁開:3.8 mm)和CA1區(qū)放射層(Bregma后3.8 mm,中線旁開:2.9 mm)。

1.3 給藥及LTP記錄

電極到達(dá)預(yù)定的刺激/記錄部位后,用電刺激器(日本光電,SEN-3301)和刺激隔離器(日本光電,SS-102J)每 30 s給予 Schaffer側(cè)支一個(gè)波寬為50 μ s、強(qiáng)度為100～150 μ A 的直流電刺激誘發(fā) fEPSPs,記錄基礎(chǔ)fEPSPs。刺激強(qiáng)度選用最大反應(yīng)刺激強(qiáng)度的30%～40%。給藥前,記錄30 min基礎(chǔ)fEPSPs以確?；A(chǔ)性突觸傳遞的穩(wěn)定性;用微量注射泵(KD Scientific,Inc,KDS310 Plus,USA)和5 μ l微量注射器經(jīng)導(dǎo)管以 0.1 μ l/min 的速度將藥物(Aβ25-35、BDNF、BDNF+Aβ25-35)注入海馬。其中,聯(lián)合給藥組BDNF預(yù)處理15 min后再給予Aβ25-35;對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。給藥后,繼續(xù)記錄30min基礎(chǔ)fEPSPs,以觀察藥物對(duì)基礎(chǔ)性突觸傳遞的影響;之后,施加3串頻率為200 Hz的高頻刺激(high-frequency stimuli,HFS)誘發(fā)LTP。每串HFS包含20個(gè)脈沖,3串HFS的間隔為30 s;HFS后,連續(xù)記錄1 h fEPSPs以觀察LTP的持續(xù)性變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

LTP主要考察fEPSPs的幅度變化。先將每只大鼠fEPSPs的幅度標(biāo)化,即以其基礎(chǔ)fEPSPs的幅度值作為100%,計(jì)算HFS前后各時(shí)間點(diǎn)fEPSPs幅度改變的百分比。之后再將同組動(dòng)物相同時(shí)刻的幅度百分比進(jìn)行平均,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。HFS后fEPSPs幅度值增加超過50%為LTP的成功誘導(dǎo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS軟件,通過重復(fù)測量方差分析(repeated measures ANOVA)計(jì)算HFS后相同時(shí)刻各組fEPSP之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 海馬內(nèi)單獨(dú)注射Aβ25-35或BDNF不影響CA1區(qū)基礎(chǔ)性fEPSPs

為了判斷Aβ25-35和 BDNF本身是否影響海馬CA1區(qū)的基礎(chǔ)性突觸傳遞,我們比較了給藥前15 min和給藥后5 min、15 min及30 min四個(gè)時(shí)刻的基礎(chǔ)性fEPSPs的幅度。Aβ25-35組(2 nmol)四個(gè)時(shí)刻的基礎(chǔ)性fEPSPs的幅度分別為99.6%±0.5%、100.1%±1.1%、101.0%±0.6%和100.5%±0.7%;BDNF組(0.1 μ g)四個(gè)時(shí)刻的基礎(chǔ)性fEPSPs的幅度分別為100.5%±0.8%、99.3%±1.1%、98.7%±1.4%和98.8%±0.8%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,海馬內(nèi)分別注射Aβ25-35和BDNF對(duì)海馬CA1區(qū)基礎(chǔ)性fEPSPs均沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.2 HFS成功誘導(dǎo)了在體大鼠海馬CA1區(qū)突觸易化和LTP

為了觀察腦內(nèi)深部的HFS能否在大鼠CA1區(qū)成功誘導(dǎo)LTP,我們?cè)谟涗浕A(chǔ)性fEPSPs的基礎(chǔ)上,給大鼠Schaffer側(cè)支施加了一組HFS。對(duì)照組HFS引起的fEPSP的幅度逐個(gè)增加,顯示明顯的突觸傳遞易化現(xiàn)象(圖1A)。HFS結(jié)束后的即刻,對(duì)照組由測試刺激引起的fEPSPs幅度變化值則由HFS前的100%增加到202.5%±2.0%。一個(gè)小時(shí)后,fEPSP仍然維持在155.8%±3.1%(圖1B)。

Fig.1 Three trains of HFS successfully induced synaptic facilitation and LTP in hippocampal CA1 region

2.3 海馬內(nèi)注射Aβ25-35明顯抑制了海馬LTP的誘導(dǎo)和維持

在成功誘導(dǎo)在體海馬LTP的基礎(chǔ)上,我們觀察了海馬內(nèi)注射Aβ25-35對(duì)海馬LTP誘導(dǎo)和維持的影響。海馬CA1區(qū)急性單獨(dú)給予 2 nmol Aβ25-35后,與對(duì)照組相比,HFS引起的LTP明顯受到抑制。HFS刺激后即刻、30 min和60 min時(shí),單獨(dú)給予Aβ25-35組的fEPSPs幅度分別為156.4%±3.8%、132.1%±4.1%和129.5%±2.8%,明顯低于對(duì)照組的202.5%±2.0%、158.2%±4.8%和155.8%±3.1%(P＜0.01,圖2)。

2.4 海馬內(nèi)注射0.1 μ g BDNF不影響 CA1區(qū) LTP的誘導(dǎo)和維持

為了研究BDNF的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)機(jī)制,我們首先觀察了腦內(nèi)注射BDNF本身是否對(duì)海馬LTP產(chǎn)生影響。與對(duì)照組相比,海馬CA1區(qū)急性單獨(dú)給予0.1 μ g BDNF后,基礎(chǔ)突觸傳遞以及HFS誘發(fā)的LTP均沒有明顯改變,兩組fEPSP幅度隨時(shí)間的變化幾乎重疊。HFS刺激后即刻、30 min和60 min時(shí),單獨(dú)給予BDNF組的平均fEPSPs的幅度值分別為195.2%±3.2%,160.8%±3.4%和154.7%±1.5%,與對(duì)照組三個(gè)時(shí)刻的fEPSPs幅度值相比,均無顯著性差異(P＞0.05,圖2)。

Fig.2 Effect of A β25-35and BDNF injection on the hippocampal LTP(±s,n=6)

2.5 BDNF預(yù)處理劑量依賴性阻斷Aβ25-35對(duì)海馬LTP的抑制效應(yīng)

為了證實(shí)BDNF是否具有保護(hù)海馬LTP免受Aβ傷害的作用,我們觀察了BDNF預(yù)處理后Aβ25-35(BDNF+Aβ25-35)的效應(yīng)。與單獨(dú)給予Aβ25-35相比,HFS 后 fEPSPs平均幅度在0.1 μ g BDNF+Aβ25-35組有明顯提高。HFS刺激后即刻、30 min和60 min時(shí),BDNF+Aβ25-35組的fEPSPs平均幅度分別為177.6%±4.8%,148.7%±2.8%和145.7%±3.1%,與單獨(dú)給予Aβ25-35組相比,幅度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,圖3)。

為了進(jìn)一步證實(shí)BDNF保護(hù)海馬LTP免受Aβ傷害的作用是否具有劑量依賴性,我們又觀察了較低劑量和較高劑量的BDNF預(yù)處理效應(yīng)(0.02 μ g BDNF+Aβ25-35;0.5 μ g BDNF+Aβ25-35)。與單獨(dú)給予Aβ25-35相比,0.02 μ g BDNF預(yù)處理組沒有改善損傷的LTP,HFS刺激后即刻、30 min和60 min時(shí),fEPSPs平均幅度分別為159.4%±2.8%、136.5%±4.4%和131.4%±2.7%(P＞0.05);而 0.5 μ g BDNF 預(yù)處理組明顯改善了LTP的傷害,HFS刺激后的三個(gè)時(shí)刻點(diǎn),fEPSPs平均幅度分別為 185.5%±2.3%、157.8%±2.3%和152.3%±3.2%(P＜0.01)。三個(gè)聯(lián)合給藥組比較的結(jié)果顯示,中等劑量(0.1 μ g)BDNF和較高劑量(0.5 μ g)BDNF預(yù)處理組與較低劑量(0.02 μ g)組相比,幅度差異在三個(gè)不同的時(shí)刻均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,圖3)。

Fig.3 BDNF dose-dependently prevented against Aβ25-35-induced impairment of hippocampal LTP(±s,n=6)

3 討論

Aβ在腦內(nèi)的積聚及其神經(jīng)毒性作用被認(rèn)為是造成AD的一個(gè)主要致病因素[2]。AD轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Aβ主要積聚在海馬和皮層,同時(shí)還存在AD樣的其它病理改變以及空間記憶的損害。有研究表明,AD病人腦內(nèi)存在有突觸傳遞和突觸可塑性的功能障礙;在體及離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也均證實(shí),Aβ對(duì)海馬LTP具有明顯的傷害作用。然而,目前Aβ抑制海馬LTP的在體或離體實(shí)驗(yàn)大多經(jīng)腦室給藥或腦片灌流進(jìn)行。這些實(shí)驗(yàn)本身需要使用較多的藥物,成本較高;同時(shí),進(jìn)入腦室后Aβ可廣泛作用于腦的不同部位,很難說明其對(duì)海馬突觸傳遞的直接效應(yīng)。本研究在記錄海馬CA1區(qū)fEPSPs的基礎(chǔ)上,將微量(2 nmol)的Aβ25-35直接注射到海馬CA1區(qū),觀察了局部給予Aβ25-35對(duì)海馬突觸傳遞的直接效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn),急性注射Aβ25-35不影響基礎(chǔ)性fEPSPs,但能較快地抑制LTP的誘導(dǎo)與維持。這表明,海馬內(nèi)本身沉積的Aβ可以直接抑制海馬LTP。

BDNF是人體內(nèi)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有保護(hù)神經(jīng)元、維持神經(jīng)突起生長和保障突觸傳遞正常進(jìn)行等重要作用。研究表明,BDNF在海馬表達(dá)水平最高[3],對(duì)海馬LTP的維持起關(guān)鍵作用,可影響人和動(dòng)物的學(xué)習(xí)與記憶功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AD患者海馬中不僅沉積有大量的以Aβ為主要成分的老年斑,還出現(xiàn)BDNF含量的明顯降低;低聚體Aβ1-42也能使海馬BDNF的含量明顯降低[7]。這提示,Aβ可能通過傷害BDNF的表達(dá)及其功能,從而加重AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元的變性,降低突觸可塑性,并最后影響認(rèn)知記憶功能。當(dāng)然,也有報(bào)道表明,AD老年斑內(nèi)存在BDNF免疫活性物質(zhì);側(cè)腦室急性輸入Aβ25-35可以使大鼠海馬BDNFmRNA表達(dá)明顯增加。這或許是大鼠對(duì)抗Aβ25-35損傷的一種自我保護(hù)機(jī)制,說明BDNF可能參與Aβ所致神經(jīng)元損傷的代償作用。Zhou等人[6]的研究表明,BDNF和Aβ聯(lián)合給予可明顯改善Aβ所致的小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量下降和空間學(xué)習(xí)記憶能力傷害。然而,BDNF改善腦認(rèn)知功能的電生理機(jī)制特別是對(duì)在體海馬LTP的研究尚不多。已有實(shí)驗(yàn)表明,BDNF基因敲除小鼠的LTP出現(xiàn)明顯抑制,外源性補(bǔ)充BDNF后,被抑制的海馬LTP能恢復(fù)到正常大小。本實(shí)驗(yàn)的主要目標(biāo)是以在體海馬LTP為觀察對(duì)象,研究BDNF拮抗Aβ的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。為了避免較大劑量的BDNF引起基礎(chǔ)性fEPSPs自發(fā)增大[8],我們?cè)诼?lián)合給藥組中選用的最大劑量BDNF為 0.5 μ g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海馬 CA1區(qū)直接給予BDNF不影響基礎(chǔ)性fEPSPs,也不影響海馬CA1區(qū) LTP的誘導(dǎo)與維持,但給予0.1 μ g和0.5 μ g的 BDNF 預(yù)處理后,Aβ25-35引起的大鼠在體海馬LTP的抑制能夠被有效阻斷,并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性效應(yīng)。這一結(jié)果表明,BDNF預(yù)處理能有效拮抗Aβ25-35對(duì)海馬神經(jīng)元所造成的神經(jīng)毒性作用,維持海馬正常的突觸傳遞。

盡管BDNF保護(hù)海馬LTP和記憶行為免受Aβ傷害的分子機(jī)制仍然有待進(jìn)一步深入研究,但據(jù)目前報(bào)道,Aβ引起海馬突觸可塑性發(fā)生障礙的機(jī)制可能與Aβ抑制CaMKII的激活和減弱AMPA受體磷酸化有關(guān);相反BDNF對(duì)LTP的保護(hù)作用可能是通過與TrkB受體結(jié)合后,促進(jìn)了CaMKII的自身磷酸化和AMPA受體的磷酸化,進(jìn)而改善了突觸傳遞可塑性[9]。另外,Vitolo等在小鼠海馬腦片LTP的實(shí)驗(yàn)中證實(shí),Aβ1-42對(duì)LTP誘導(dǎo)的抑制作用可能是通過抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化,使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低,蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)失活,最終使轉(zhuǎn)錄因子CREB(cAMP responsible element binding protein)不能磷酸化而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所致。BDNF和TrkB的結(jié)合可以激活PKA,從而磷酸化CREB并啟動(dòng)下游基因的表達(dá),最終使得內(nèi)源性Aβ減少,改善已經(jīng)損傷的學(xué)習(xí)記憶功能,以上部分推論已被Caccamo等所證實(shí)[10]。

總之,本實(shí)驗(yàn)首次利用記錄在體大鼠海馬CA1區(qū)LTP的方法,探討了海馬CA1區(qū)局部給予外源性BDNF對(duì)突觸傳遞可塑性的保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果表明:海馬局部注射微量的Aβ25-35可造成明顯的LTP傷害;不同濃度的BDNF預(yù)處理則能劑量依賴性阻斷Aβ25-35引起的LTP抑制,對(duì)突觸傳遞可塑性具有明顯的保護(hù)作用。因此,本實(shí)驗(yàn)不僅為BDNF神經(jīng)保護(hù)作用提供了電生理學(xué)方面的支持性證據(jù),也提示腦內(nèi)BDNF水平的適當(dāng)上調(diào)可能有助于防止AD患者早期出現(xiàn)的認(rèn)知功能下降。

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