多基因SNP位點(diǎn)及多種危險(xiǎn)因素與老年漢族冠心病的關(guān)聯(lián)分析*

孫玉發(fā),曹 劍,李曉利,,范 利△,王 強(qiáng),王 卉,張 紅,楊 莉,張 帆

(1.解放軍總醫(yī)院南樓心血管一科,北京 100853;2.解放軍第309醫(yī)院干部病房;3.國防大學(xué)第一干休所;4.八一隊(duì)干休所,北京 100091)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)在老年人群中高發(fā),是老年疾病的一種。由于受到社會經(jīng)濟(jì)水平、生活方式以及老齡化進(jìn)程加速的影響,冠心病迅速成為中國老年人群的主要疾病以及主要死亡原因,同時與冠心病相關(guān)的危險(xiǎn)因素較50年代發(fā)生了明顯變遷。CHD確切的病因并未完全闡明。遺傳易感性與危險(xiǎn)因素交互作用是CHD發(fā)病的主要機(jī)制。CHD歸屬于多基因遺傳疾病,因此采用高通量基因?qū)W或全基因組學(xué)方法研究CHD遺傳易感性必將成為研究CHD基因?qū)W的趨勢[1]。多基因遺傳疾病的特點(diǎn)在于多種微效基因存在累加效應(yīng)。推測多種微效基因的改變,導(dǎo)致某些與CHD病因相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)以及數(shù)量改變,使得與危險(xiǎn)因素包括可控制因素(比如高血壓、吸煙、高脂血癥、生活方式等)與不可控制因素(年齡、性別、CHD家族史等)的交互作用模式發(fā)生改變,從而導(dǎo)致CHD的發(fā)生與發(fā)展。

基于以上的認(rèn)識,我們研究了影響CHD發(fā)生的15種常見危險(xiǎn)因素以及10種易感基因。借助新型高通量的基因多態(tài)性分型研究技術(shù),采用候選基因方法,篩選了10種與已有報(bào)道與老年疾病比如與糖尿病、冠心病、高血壓、老年性癡呆、高脂血癥、動脈血栓及栓塞等疾病相關(guān)的基因,包括:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE),血小板糖蛋白(glycoprotein Iba,GPIba),亞甲基四氫葉酸還原酶(mthylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR),血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),微管相關(guān)蛋白tau(microtubule-associated protein tau,MAPT),血小板糖蛋白6(platelet glycoprotein 6,GP6),纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1 gene),環(huán)氧化酶(cycloxygenase-1,COX-1),血小板ADP受體(purinergic receptor P2Y1,P2Y1),抗凝血酶(antithrombin III,ATIII),共10種基因11單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與CHD關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析。

1 材料及方法

1.1 研究方法

采用病例-對照研究方法。

1.2 研究對象

人群來自于2008年4月～2010年7月解放軍總醫(yī)院、解放軍309醫(yī)院、海軍總醫(yī)院以及25個軍隊(duì)干休所共246例老年漢族冠心病漢族患者,同時入選老年非冠心病患者185例作為對照組。符合其中一項(xiàng)診斷為冠心病:(1)慢性穩(wěn)定型心絞痛患者;(2)陳舊性心肌梗死患者;(3)經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后患者或外科冠狀動脈搭橋(CABG)術(shù)后患者;(4)年齡≥65歲的漢族人群。排除標(biāo)準(zhǔn):不能配合調(diào)查,不愿參加調(diào)查者。本研究通過中國人民解放軍總醫(yī)院科學(xué)和倫理審查委員會批準(zhǔn);所有病人提供書面知情同意后方可入選。

1.3 問卷調(diào)查

主要內(nèi)容包括:年齡、性別、民族、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥等。

1.4 血樣標(biāo)本采集

抽取大約10 ml靜脈血。檢測指標(biāo)包括:同型半胱氨酸,氨基末端腦鈉肽前體,超敏C反應(yīng)蛋白,抗凝血酶III,膽固醇,甘油三酯,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白等。

1.5 DNA提取和SNP檢測

DNA提取采用傳統(tǒng)采用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)方法。利用Sequenom系統(tǒng)利用激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行SNP基因分型。設(shè)計(jì)3條引物,2條用于PCR,用于目的基因延伸,1條引物(探針)用于單堿基延伸,針對SNP突變位點(diǎn),突變位點(diǎn)檢測是通過質(zhì)譜儀對分子質(zhì)量的不同進(jìn)行檢測,利用特定軟件,設(shè)計(jì)不同分子質(zhì)量的引物探針,不同的SNP位點(diǎn)在質(zhì)譜圖上會形成不同的峰,彼此之間無重疊,從而根據(jù)分子質(zhì)量之間的差異,完成多重SNP檢測。具體根據(jù)SNP位點(diǎn)序列,采用Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物情況見表1。SNP_ID為SNP序列號;1st-PCRP和2nd-PCRP為PCR擴(kuò)增引物,DIR為擴(kuò)增方向,F指PCR擴(kuò)增的為SNP位點(diǎn),R指PCR擴(kuò)增的為SNP位點(diǎn)互補(bǔ)鏈,對標(biāo)識R的SNP,在結(jié)果分析時需要置換成SNP位點(diǎn)對應(yīng)位點(diǎn)堿基。Mass為探針分子質(zhì)量;probe為單堿基延伸引物(探針)。SNP檢測采用美國Sequenom系統(tǒng)SNP分型技術(shù),具體見Sequenom系統(tǒng)SNP分型技術(shù)操作手冊。擴(kuò)增效率大于75%的樣本,納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 13.0完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),正態(tài)分布計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn),資料描述采用平均數(shù)加標(biāo)準(zhǔn)差(±s),偏態(tài)計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)方法檢驗(yàn),資料描述采用中位數(shù)M,變異范圍用5%分位數(shù)到95%分位數(shù)(P5-P95)描述。冠心病危險(xiǎn)因素篩查分析是將單因素檢驗(yàn)P＜0.01的參數(shù),納入多因素非條件性Logistic回歸法。SNP位點(diǎn)等分析采用:(1)應(yīng)用haploview 4.2軟件對總體樣本進(jìn)行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg,H-W)分析;(2)應(yīng)用THESIS軟件對病例對照組基因型頻率進(jìn)行χ 2關(guān)聯(lián)分析;(3)在基因型/頻率關(guān)聯(lián)分析基礎(chǔ)上,陽性結(jié)果應(yīng)用在線軟件SNPstats進(jìn)行非條件Logistic回歸模型評估基因型與CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)程度,并計(jì)算優(yōu)勢比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)。

Tab.1 Primers and probes in 11 SNPs of 10 genes

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)特征與危險(xiǎn)因素分析

表2所示共計(jì)調(diào)查了431例老年漢族患者,冠心病246例,非冠心病185例,冠心病占總數(shù)57.08%。單因素分析冠心病患者與非冠心病患者相比,性別、吸煙、飲酒、糖尿病、高脂血癥、同型半胱氨酸、超敏C反應(yīng)蛋白、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白,統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異(P＞0.05)。但年齡、高血壓、抗凝血酶III、氨基末端腦鈉肽前體、低密度脂蛋白,在冠心病與非冠心病患者中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。將單因素分析P＜0.10的參數(shù)包括:年齡、高血壓、高脂血癥、氨基末端腦鈉肽前體、抗凝血酶III、膽固醇、低密度脂蛋白納入非條件Logistic回歸二次分析。結(jié)果顯示增齡、高血壓為冠心病危險(xiǎn)因素,P值分別是0.00,0.05和0.02,95%CI分別為(1.01,1.05),(1.05,2.84)和(1.08,2.74),ATIII為冠心病保護(hù)因素,ATIII在非CHD患者中高表達(dá)(107.02%±14.09%vs103.27%±13.91%),P值為0.00,CI為(0.96,0.99)(表3)。

2.2 SNP與冠心病關(guān)聯(lián)分析

haploview 4.2對10個基因11個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行HW平衡檢驗(yàn),所有位點(diǎn)符合HW平衡,所有位點(diǎn)擴(kuò)增效率大于75%,全部納入SNP與冠心病相關(guān)分析。應(yīng)用THESIS軟件對病例對照組基因型頻率進(jìn)行χ2關(guān)聯(lián)分析結(jié)果提示GP1BA rs6065(524C/T),MTHFR rs1801133(677C/T),HO-1 rs2071746(-413A/T),MAPT rs242557(A/G),ACE rs4332(547C/T),GP6 rs1613662(13254T/C),PAI-1 rs2227631(-844 G/A),COX-1rs1330344(1676C/T)和P2RY1 rs1065776(893C/T)與冠心病無明確相關(guān)(表4)。而GP1BA rs2243093(-5T/C)與冠心病呈現(xiàn)相關(guān)趨勢,P=0.06接近0.05,CC基因型是冠心病發(fā)生危險(xiǎn)因素,OR=2.83 CI=(1.03,7.76)。ACE rs4332(547C/T)與冠心病明確相關(guān),P=0.01。野生型CC為CHD危險(xiǎn)因素,OR=1.55 CI=(1.04,2.31);ATIII rs2227589(893C/T)與CHD相關(guān),P=0.01,CC野生型為CHD保護(hù)因素,OR=0.56,CI=(0.38,0.82)。

3個陽性位點(diǎn)GP1BA rs2243093(-5T/C),ACE rs4332(547C/T),ATIII rs2227589(893C/T)應(yīng)用在線軟件SNPstats進(jìn)行非條件Logistic回歸模型評估與CHD相關(guān)性(表5)。結(jié)果顯示:GP1BA rs2243093(-5T/C),與TT+CT基因型相比,突變CC基因型是CHD發(fā)生危險(xiǎn)因素,P=0.029,OR=2.83,CI=(1.03,7.76),經(jīng)年齡、高血壓,高脂血癥、ATIII三個冠心病危險(xiǎn)因素校正后,突變CC基因型是CHD的危險(xiǎn)因素,P=0.014;ACE rs4332(547C/T),雜合型TC基因型是CHD的保護(hù)因素,P=0.003,OR=0.51,CI=(0.34～0.77),純合子TT和CC是CHD的危險(xiǎn)因素。經(jīng)年齡、高血壓,ATIII三個CHD危險(xiǎn)因素校正后,P=0.001,OR=0.51,CI=(0.34～0.77)。ATIII rs2227589(893C/T),突變基因T攜帶者CT+TT基因型是CHD的危險(xiǎn)因素,P=0.003,OR=1.79,CI=(1.22～2.63),經(jīng)年齡、高血壓、高脂血癥、ATIII校正后,P=0.006,OR=1.76,CI=(1.17～2.63)。

Tab.2 Demographic details for the patients

Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of clinical risk factors with CHD

Tab.4 Correlation analysis of 11SNPs of 10-plex genes with CHD

Tab.5 Correlation analysis of SNPs of GP1BA,ACE,ATIII with CHD by logistic regression

3 討論

盡管CHD發(fā)病具有普遍性,但是,受到不同地域、不同人種、性別、年齡,不同生活方式等的影響,CHD發(fā)病有其自身的特點(diǎn)。文獻(xiàn)陸續(xù)報(bào)道的CHD危險(xiǎn)因素已有300多個,包括了性別、年齡、吸煙、家族史、血脂異常、高血壓、糖尿病、凝血和纖溶功能異常,感染和炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,同型半胱氨酸等,但年齡、高血壓、高脂血癥仍舊是CHD共同的危險(xiǎn)因素[2]。動脈粥樣硬化是CHD發(fā)病的病理基礎(chǔ),動脈粥樣硬化起自少兒期,30～49歲冠狀動脈粥樣硬化急劇進(jìn)展,中老年之后逐漸出現(xiàn)CHD的癥狀。在我們的研究當(dāng)中,顯示增齡、高血壓、是中國老年漢族患者CHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素,而吸煙、肥胖、糖尿病不是構(gòu)成中國老年漢族患者CHD的主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。

CHD是一種多基因遺傳疾病,CHD關(guān)聯(lián)基因?qū)HD風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測作用不亞于傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素,CHD關(guān)聯(lián)基因的揭示發(fā)揮著推動 CHD個性化治療的作用[3]。推測大約有500個基因參與了冠心病的發(fā)生發(fā)展[4]。CHD遺傳易感性存在人種的差異性。某些CHD易感位點(diǎn)可能在高頻出現(xiàn)某一人種,從而構(gòu)成主要的致病基因。單一致病基因?qū)HD貢獻(xiàn)不大,多種致病基因累積是CHD發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。因此,研究中國人群CHD遺傳易感性,必須首先明了對CHD哪些基因及易感位點(diǎn)對中國人群CHD構(gòu)成危害。10種基因11SNP與CHD關(guān)聯(lián)分析研究結(jié)果提示,中國老年患者存在CHD三種易感性基因以及對應(yīng)的3個SNPs位點(diǎn),分別是GPIba(rs2243093),ACE(rs4332)和ATIII(rs2227589)。而已有報(bào)道與CHD相關(guān)的基因或位點(diǎn)GPIbars6065,GP6 rs1613662,HO-1 rs2071746,MTHFR rs1801133,PAI-1 rs2227631卻與中國老年CHD無關(guān)聯(lián)。COX-1和P2RY1與參與阿司匹林抗血小板作用,本研究中未發(fā)現(xiàn) MAPT、COX-1和 P2RY1 SNP位點(diǎn) rs7831,rs242557,rs1330344和rs1065776 CHD關(guān)聯(lián)。

血小板糖蛋白Iba(glycoprotein Iba,GPIbα)是血小板表面vWF因子受體亞單位,GP Iba-Ibβ-IX-V共同構(gòu)建成vWF因子受體,該受體復(fù)合物與vWF結(jié)合位點(diǎn)位于GP IbaN-端結(jié)構(gòu)域,vWF因子-GP Ib/IX/V交聯(lián)參與動脈血栓性疾病形成[5],GPIba rs2243093(-5T/C),T/C多態(tài)性位于啟動子區(qū)kozak序列,有報(bào)道C等位基因攜帶者,血小板GPIb-IX-V在體外和體內(nèi)受體表達(dá)增加。我們的研究結(jié)果顯示了GPIba rs2243093(-5T/C)與CHD相關(guān)。而另一個GPIba rs 6065(2217C/T)引起位于vWF受體結(jié)合域第145位蘇氨酸/蛋氨酸(Thr/Met)改變,同樣有報(bào)道rs 6065(524C/T)與動脈血栓性疾病相關(guān)聯(lián),我們的結(jié)果不支持GPIbαrs 6065與CHD相關(guān)聯(lián)。

抗凝血酶III(antithrombin,ATIII)反映機(jī)體抗凝血的功能。CHD患者存在不同程度的高凝狀態(tài)。1991年,俄國Koshkin IuP等研究發(fā)現(xiàn)具有CHD家族史的患者,發(fā)現(xiàn)抗凝血酶III活動度可以作為一個CHD遺傳易感性的一個標(biāo)志。我們研究結(jié)果顯示:無論從蛋白水平以及從基因水平上,ATIII與 國人CHD相關(guān)聯(lián)。在蛋白水平上,ATIII在非CHD人群中呈現(xiàn)高表達(dá)(107.02%±14.09%),在CHD中呈現(xiàn)低表達(dá)(103.27%±13.91%)。在基因水平上,發(fā)現(xiàn)ATIII rs2227589(893C/T)與國人CHD相關(guān)聯(lián)。純合子野生型CC基因型是CHD保護(hù)因素,在非CHD患者中出現(xiàn)頻率為58.92%,在CHD患者中出現(xiàn)頻率為44.49%。除外同動脈血栓關(guān)聯(lián)之外,另外有報(bào)道ATIII rs2227589(893C/T)突變引起抗凝血酶活性減低與深靜脈血栓形成相關(guān)聯(lián)[6]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-convertion enzyme,ACE)ACE插入/缺失性(I/D)多態(tài)性基因多態(tài)性與CHD相關(guān)聯(lián),報(bào)道頗多。D突變體攜帶者,ACE表達(dá)上調(diào)[7],腎素-血管緊張素-醛固酮軸活性增加,包括動脈硬化、心肌梗死、阿爾茨海默病等風(fēng)險(xiǎn)增加。我們在研究中發(fā)現(xiàn)另一個ACE基因多態(tài)性位點(diǎn)rs4332(547C/T)與CHD相關(guān)聯(lián)。rs4332位于內(nèi)含子區(qū)域,雜合型CT基因型是冠心病的保護(hù)因素,而CC+TT基因型則是CHD危險(xiǎn)因素。推測位于內(nèi)含子區(qū)域的突變位點(diǎn)不影響ACE分子結(jié)構(gòu),可能通過影響基因剪切、拼接,從而影響ACE轉(zhuǎn)錄效率,其作用機(jī)理,有待于進(jìn)一步深入探索。

本研究初步探索老年CHD患者發(fā)病的部分環(huán)境危險(xiǎn)因素和遺傳學(xué)基礎(chǔ),結(jié)果證明了增齡、高血壓、抗凝血酶III下降是影響老年冠心病的主要危險(xiǎn)因素。同時證明了血小板、抗凝血系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)三種機(jī)制參與了老年冠心病的發(fā)生與發(fā)展,為老年CHD的臨床干預(yù)提供了一定的流行病學(xué)及遺傳學(xué)依據(jù)。

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