埃他卡林對低氧性肺動脈高壓患者某些血清酶活性及自由基代謝的影響*

崔建華,高 亮,張東祥,肖忠海,楊海軍,李 彬,馬廣全,汪 海△

(1.解放軍第18醫(yī)院全軍高山病防治研究中心,新疆 葉城 844900;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津 300050)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)多發(fā)生于移居高原(海拔3 000 m以上)者,移居3個月以上發(fā)病,發(fā)生機(jī)制包括低氧性肺血管收縮、繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥導(dǎo)致血液粘滯度增加以及肺血管結(jié)構(gòu)重建等。隨著肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入、分子生物學(xué)日新月異的發(fā)展,已有越來越多的證據(jù)提示,任何原因引起的肺動脈高壓均可導(dǎo)致肺血管結(jié)構(gòu)重建(remodeling)、管壁增厚、管腔狹窄以致閉塞[1]。在HPH的治療中血管擴(kuò)張劑的療效不僅取決于藥物的藥理作用,而且也取決于病變的性質(zhì)及程度。目前有關(guān)治療HPH的特效藥物不多,埃他卡林(iptkalim,Ipt)是我國自行設(shè)計(jì)、合成、具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型KATP開放劑(KATPCO)[2],在不影響正常體循環(huán)血壓的劑量下,產(chǎn)生選擇性抗肺動脈高壓作用。本文應(yīng)用Ipt在海拔5 000 m(5 070 m、5 200 m和5 380 m)以上高原治療HPH,觀察血清酶活性的變化以及血中與過氧化反應(yīng)關(guān)系密切的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和過氧化脂質(zhì)的最終分解產(chǎn)物丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量,以及一氧化氮(nitric oxide,NO)含量及其合酶(nitric oxide synthase,NOS)的活性變化,以便為其發(fā)展為新型治療HPH的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 受試對象

受試者為年齡18～24歲,男性,平原出生,進(jìn)入高原5 070～5 380 m 1年以上。進(jìn)駐高原前體檢確認(rèn)健康,均自愿參加本次研究,并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]:(1)經(jīng)超聲心動圖診斷有肺動脈高壓;(2)心電圖電軸右偏及明顯右心室肥厚。超聲、心電檢查由專業(yè)人員操作。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與藥物 便攜式超聲診斷儀(美國通用電氣LOGIQ BOOK XP,探頭頻率2.5 MHz);Ipt及安慰劑由北京恩華醫(yī)藥研究院提供,規(guī)格分別為5 mg/tab和0 mg/tab。安慰劑與埃他卡林片色、香、味相同,經(jīng)檢驗(yàn)符合國家安慰劑規(guī)定的相關(guān)要求。

1.2.2 分組與給藥:試驗(yàn)采用隨機(jī)雙盲安慰劑對照設(shè)計(jì)。初次進(jìn)入高原5 070～5 380 m 6個月以上的受試者,經(jīng)體檢確診為肺動脈高壓者,進(jìn)入該臨床研究。臨床試驗(yàn)分為Ipt治療組(試驗(yàn)組,n=74)與安慰劑對照組(n=36)。試驗(yàn)藥物每日清晨9∶00～10∶00口服一次,Ipt每片5 mg,每日1次,安慰劑每片0 mg,每日1次,連續(xù)口服6個月。

1.2.3 檢測指標(biāo) 服藥前和服藥6個月后分別采空腹靜脈血檢測血清酶活性和自由基代謝相關(guān)指標(biāo)。血清心肌酶活性檢測的指標(biāo)有:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltransferase,γ-GT)、肌酸激酶 (creatine kinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒由南昌百特生物高新技術(shù)有限公司提供。自由基檢測的指標(biāo)有:MDA、NO的含量、SOD和NOS的活性,試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。所有標(biāo)本的處理及檢測均由專人負(fù)責(zé)。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 Ipt對海拔5 000 m以上HPH患者某些血清酶含量的影響

服藥前試驗(yàn)組與對照組 ALT、AST、γ-GT、CK、LDH含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。服藥6個月后試驗(yàn)組較對照組ALT、AST、γ-GT、CK、LDH 含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,表1)。

2.2 Ipt對海拔5 000 m以上HPH患者自由基代謝的影響

服藥6個月后試驗(yàn)組較對照組SOD活性增高、NO含量、NOS活性增高,MDA含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);服藥前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05,表 2)。

Tab.1 Effect of Ipt on the HPH enzymes of men living above 5 000m altitude(U/L,±s)

Tab.1 Effect of Ipt on the HPH enzymes of men living above 5 000m altitude(U/L,±s)

ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase;γ-GT:γ-Glutamyltransferase;CK:Creatine kinase;LDH:Lactate dehydrogenase;Ipt:Iptkalim;HPH:Hypoxic pulmonary hypertension*P＜0.05 vs placebo group

Group n ALT AST γ-GT CK LDH Before treatment Placebo 36 46.20±5.10 46.80±6.93 60.70±9.46 175.00±15.90 243.08±46.95 Experiment 74 45.10±6.38 44.60±6.39 60.40±8.76 173.00±14.30 243.45±43.22 After treatment Placebo 36 65.90±10.40 66.47±9.73 74.97±6.51 222.60±30.21 309.92±38.18 Experiment 74 56.70±9.87* 56.30±11.40* 66.53±8.96* 200.90±25.38*285.85±25.97*

Tab.2 Effect of Ipt on the HPH free radicals of men living above 5 000m altitude(±s)

Tab.2 Effect of Ipt on the HPH free radicals of men living above 5 000m altitude(±s)

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malonaldehyde;NO:Nitric oxide;NOS:Nitric oxide synthase;Ipt:Iptkalim;HPH:Hypoxic pulmonary hy pertention*P＜0.05 vs placebo group

Group n SOD(u/ml)MDA(nmol/ml)NOS(u/ml)NO(μ mol/L)Before treatment Placebo 36 79.37±8.36 5.80±1.35 50.71±10.99 63.26±13.76 Experiment 74 78.93±6.76 5.73±1.15 51.96±14.01 64.89±16.34 After treatment Placebo 36 64.18±7.28 8.67±1.77 34.40±7.01 48.10±7.99 Experiment 74 71.09±8.78* 6.74±1.64* 40.24±6.64* 57.70±12.80*

3 討論

HPH是慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)中最常見的一類疾病,如果不及時(shí)治療,嚴(yán)重者可發(fā)展為嚴(yán)重的心臟病、心衰、甚至危及生命。目前治療HPH的藥物主要是通過舒張肺血管平滑肌達(dá)到降低肺動脈壓的目的,新近的研究資料表明,肺血管收縮在肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)理中的作用遠(yuǎn)沒有肺血管重構(gòu)重要[4]。作為這些肺血管活性物質(zhì)的共同作用部位,鉀ATP通道在低氧性肺血管收縮和重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。Ipt為ATP敏感性鉀通道開放劑,可增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性耐缺氧能力,減輕機(jī)體低氧性損傷[5,6],改善持續(xù)低氧引起肺動脈高壓時(shí)肺內(nèi)動脈重構(gòu)的作用,從而改善通氣功能,有利于HPH的糾正。

機(jī)體在高度缺氧狀態(tài)下,致使機(jī)體細(xì)胞線粒體功能不全,ATP合成不足,鈉泵功能障礙,細(xì)胞腫脹以致細(xì)胞膜通透性增加;細(xì)胞內(nèi)二磷酸腺苷和三磷酸腺苷水解造成細(xì)胞內(nèi)酸中毒致使溶酶體膜不穩(wěn)定,溶酶體內(nèi)的水解酶釋出,損傷細(xì)胞膜使細(xì)胞膜的通透性增高;ATP減少,細(xì)胞蛋白合成與分解負(fù)平衡也影響到機(jī)體的合成與修復(fù)過程,組織或器官細(xì)胞會受到損傷,細(xì)胞膜的通透性增高,使酶釋放入血導(dǎo)致血清酶ALT、AST、γ-GT、CK 、LDH 含量不同程度的升高,預(yù)示機(jī)體尤其是心肌受到損傷。實(shí)驗(yàn)表明,心臟低氧過程中細(xì)胞內(nèi)的鈉增多,形成鈉超載;細(xì)胞鈉超載,則引起鈣超載,通過細(xì)胞內(nèi)的鈣超載引起細(xì)胞的各種損傷[7]。細(xì)胞內(nèi)的鈣超載是心肌細(xì)胞低氧損傷的關(guān)鍵,其次細(xì)胞內(nèi)鉀的丟失對細(xì)胞低氧的電生理學(xué)改變起重要作用。低氧期間,細(xì)胞外鉀離子的蓄積對心肌細(xì)胞電生理影響很大,主要表現(xiàn)為動作電位時(shí)程(APD)縮短和動作電位輻度縮小。因此,低氧鉀外流的主要原因可能是ATP敏感性鉀通道的開放。低氧狀態(tài)下,KATP通道對細(xì)胞內(nèi)ATP敏感性降低,從而提高KATP通道的活性,KATP通道開放,外向性鉀電流增加,通過加快動作電位復(fù)極化而縮短APD。

慢性低氧可導(dǎo)致過量氧自由基產(chǎn)生,體內(nèi)蓄積的氧自由基不能及時(shí)消除,進(jìn)而誘發(fā)一系列連鎖性脂質(zhì)過氧化反應(yīng),破壞細(xì)胞膜完整性,造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載,引起細(xì)胞損傷,其后果是血管內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)減弱,血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)[8],NO合成釋放減少,促進(jìn)血管平滑肌和膠原增殖[9]。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化還原代謝的改變,還可抑制肺動脈平滑肌電壓門控鉀通道(Kv)的活性,激活電壓門控性鈣通道,增強(qiáng)平滑肌興奮性,導(dǎo)致低氧性肺血管收縮反應(yīng),肺動脈壓增高[10]。

本研究表明,HPH患者服用Ipt治療6個月后ALT 、AST 、γ-GT 、CK 、LDH 含量均不同程度的降低,表明Ipt能夠通過開放線粒體KATP通道,對低氧應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用,一方面可能是由于Ipt可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上ATP酶活性和細(xì)胞內(nèi)外電介質(zhì)含量,防止細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+超載所致的細(xì)胞毒性損傷;另一方面,Ipt可增加紅細(xì)胞膜脂流動性,降低微粘度,改善缺氧損傷[11]。同時(shí),SOD活性明顯增高,MDA含量降低,揭示氧自由基參與了HPH的發(fā)生發(fā)展過程。Ipt降低肺動脈高壓作用可能與其改善微循環(huán)障礙、對肺血管選擇性擴(kuò)張作用、降低血粘度有關(guān)。胞漿游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的增加是內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌NO等血管活性物質(zhì)的一個重要的細(xì)胞信號,尤其是跨膜Ca2+內(nèi)流而引起胞內(nèi)[Ca2+]i增加是NO釋放所必備的[12]。Ipt顯著地增高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度,進(jìn)而促使NO合成增加。表明Ipt可通過上調(diào)NOS活性的表達(dá)使NO生成增多,使肺血管舒張,有效地對抗了低氧的影響,發(fā)揮了保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。Ipt通過激活肺血管內(nèi)皮細(xì)胞KATP通道,通道開放而增加其胞內(nèi)游離Ca2+濃度,進(jìn)而促使NO合成增加;減少與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,緩解肺血管重構(gòu)。因此,Ipt可以通過增加NOS活性表達(dá)和合成,以及NO的釋放保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)低氧性肺動脈高壓。靶向內(nèi)皮細(xì)胞KATP通道,保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,說明Ipt減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng),是對HPH發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制。本研究對照組服藥前后有差異可能與隨在高原居駐時(shí)間的延長,體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。

高原心臟病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵性病理生理學(xué)環(huán)節(jié)為HPH,其特征為肺動脈血壓異常增高,但體循環(huán)血壓正常。Ipt靶向ATP敏感性鉀通道,它在生理狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài),藥物作用弱,在能量代謝異常低下的病理狀態(tài)下開放,藥物作用強(qiáng)。HPH時(shí),Ipt在不影響正常體循環(huán)血壓的劑量下,產(chǎn)生選擇性抗肺動脈高壓作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明了其抑制低氧氧化應(yīng)激損傷的可能作用途徑,為進(jìn)一步研究Ipt的作用機(jī)制提供了有力依據(jù)。因此,Ipt可以有效治療低氧引起的慢性肺動脈高壓,為治療慢性肺動脈高壓開辟了新思路。

[1]陶清國.肺血管結(jié)構(gòu)改建、平滑肌細(xì)胞增生與原癌基因[J].國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊,1997,17(1):22-24.

[2]Wang Hai.Pharmacological characteristics of the novel antihypertensive drug iptakalim hydrochloride and its molecular mechanisms[J].Drug De v Res,2002,54(2):240-241.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生部職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GBZ92-2008,職業(yè)性高原病診斷標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:人民衛(wèi)生出版社.2008.

[4]Jeffery T K,Wanstall JC.Pulmonary vascular remodeling:a target for therapeutic intervention in pulmonary hypertension[J].Pharmacol Ther,2001,92(1):1-20.

[5]Wang H,Tang Y,Zhang Y L.Hypoxic pulmonary hypertension(HPH)and iptakalim,a novel ATP-sensitive potassium channel opener targeting smaller arteries in hypertension[J].CardiovascrDrug Re v,2005,23(4):293-316.

[6]Zhu H L,Luo W Q,Wang H.Iptakalim protects against hypoxic brain injury through multiple pathways associated with ATP-sensitive potassium channels[J].Neurosci,2008,157(4):884-894.

[7]Benndorf K,Bollmann G,Friedrich M,et al.Anoxia induces time-independent K+current through KATPchannels in isolated heart cells of the guinea-pig[J].J Physiol,1992,454:339-357.

[8]Chen X,Gillis C N.Effects of free radicals on pulmonary vascular response to acetylcholine[J].J Appl Physiol,1991,71(3):821-825.

[9]Mansoor A M,Honda M,Saida K,et al.Endothelin induced collagen remodeling in experimental pulmonary hypertension[J].Biochem BiophysResCommun,1995,215(3):981-986.

[10]Yuan X J,Tod M L,Rubin L J,et al.Inhibition of cytochrome P450 reduces voltage-gated K+currents in pulmonary arterial myocytes[J].Am J Physiol,1995,268(1Pt1):C259-270.

[11]劉 蔚,龍超良,崔文玉,等.鹽酸埃他卡林對小鼠腦組織缺氧的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2004,9(1):67-69.

[12]賈國棟,劉國樹,汪 海.鹽酸埃他卡林對血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2004,9(4):382-384.