固定化核蛋白小球藻對(duì)人工廢水中不同形態(tài)氮和磷的去除

劉淑坡，李 飛

（華僑大學(xué) 土木工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 362021）

氮磷污染會(huì)導(dǎo)致緩流水體的富營(yíng)養(yǎng)化和赤潮等生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，并產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，嚴(yán)重威脅人們的生命財(cái)產(chǎn)安全.例如，氮磷污染可能導(dǎo)致水體內(nèi)藻類(lèi)的過(guò)度孳生，而某些藻類(lèi)可分泌藻毒素，威脅其他水生生物及人畜的生命安全［1］.此外，排入水體的硝酸鹽在缺氧、酸性條件下，可還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與仲胺作用，會(huì)形成亞硝胺，而亞硝酸鹽和亞硝胺都有毒，并且亞硝胺是三致（即致突變、致癌、致畸形）物質(zhì)［2］.

氮磷的傳統(tǒng)去除工藝對(duì)環(huán)境條件，如pH、溫度、溶解氧等的要求比較苛刻，普遍存在運(yùn)行管理復(fù)雜，運(yùn)行費(fèi)用高等缺點(diǎn)，難以達(dá)到理想的去除效果［3－4］.早在1957年，Oswald等就提出利用藻類(lèi)去除廢水中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).利用這種方法的優(yōu)點(diǎn)是在進(jìn)行廢水處理的同時(shí)能夠利用廢水中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲得具有較高應(yīng)用價(jià)值的藻體［5］.

目前，在幾乎所有的流域保護(hù)計(jì)劃中，都假定所有形態(tài)的氮磷對(duì)增加水體的初始生產(chǎn)力具有等同的效果，并分別以總氮和總磷作為氮和磷的排放標(biāo)準(zhǔn)［6］.然而，生態(tài)環(huán)境中生物對(duì)氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的形態(tài)具有選擇性［7－8］，因此本文的目的是研究固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的去除順序和去除規(guī)律，為微藻在廢水處理領(lǐng)域的工程化應(yīng)用做一些基礎(chǔ)性研究工作.

1 試驗(yàn)部分

1.1 藻種來(lái)源

試驗(yàn)中所用的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所提供.

1.2 培養(yǎng)基及人工廢水的配制

蛋白核小球藻的培養(yǎng)采用SE培養(yǎng)基，配制方法詳見(jiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道［9］.將不含氮磷的SE培養(yǎng)基在0.145MPa（126℃）的壓力下高溫滅菌25min，冷卻至室溫，在無(wú)菌條件下用0.1mol／L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右，并向其內(nèi)投加一定量的NH4Cl、KNO3、NaNO2、KH2PO4·3H2O和六偏磷酸鈉配制成人工廢水備用.

1.3 固定化方法

本試驗(yàn)采用海藻酸鈣固定微藻，海藻酸鈣包埋固定化技術(shù)是一種使用廣泛、研究較多的包埋固定化方法，且其對(duì)細(xì)胞生存能力的影響較小.同時(shí)，其還具有原料廉價(jià)、固定化成型方便、對(duì)微生物毒性小、固定化細(xì)胞密度高、網(wǎng)絡(luò)空隙大和傳質(zhì)阻力小等優(yōu)點(diǎn)［10－11］.

海藻酸鈣固定化是在很溫和的條件下完成的，適合于大多數(shù)活細(xì)胞的包埋固定化，其具體過(guò)程如下:將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)在4000r／min的轉(zhuǎn)速下離心濃縮5min，棄去上清液，并用滅菌蒸餾水沖洗2～3次，以去除吸附在藻細(xì)胞表面的氮和磷，然后將其重新懸浮在滅菌蒸餾水中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)并定容后，形成含有一定藻細(xì)胞濃度的濃縮懸濁液.將此濃縮細(xì)胞懸濁液和4%的海藻酸鈉溶液按照1∶1的體積比混合，形成2%的海藻酸鈉－藻細(xì)胞混合液.用100mL玻璃注射器吸取適量混合液，并套上12號(hào)針頭，在距離2.5%預(yù)冷的CaCl2溶液液面20cm處滴入，即形成直徑約為4mm的凝膠小球，每個(gè)凝膠小球內(nèi)約含有2.0×106個(gè)藻細(xì)胞.將形成的凝膠小球在CaCl2溶液中靜置4h至反應(yīng)充分后，用滅菌蒸餾水沖洗2～3次后備用［12］.

1.4 檢測(cè)方法與統(tǒng)計(jì)分析

將各取樣時(shí)段獲得的樣品過(guò)0.45μm濾膜后，按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》所述之詳細(xì)步驟，分別采用納氏試劑比色法、紫外分光光度法、N－（1－萘基）－乙二胺光度法、鉬銻抗分光光度法和過(guò)硫酸鉀消解－鉬銻抗分光光度法測(cè)定廢水中殘留的氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽和總磷的濃度［13］.六偏磷酸鈉磷的濃度則根據(jù)正磷酸鹽磷濃度和總磷濃度計(jì)算得到.各形態(tài)氮磷的去除率R則可按下式計(jì)算:

式中:R表示去除率（%）；C0和Ct分別表示各種形態(tài)氮磷的初始濃度和各取樣時(shí)段濃度（mg／L）.

采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括求均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和單因素方差分析（ANOVA），并選用p＝0.01作為顯著水平.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的去除

將1600個(gè)初始藻密度約為2.0×106藻細(xì)胞／球的凝膠小球投入到盛有400mL人工廢水的三角瓶?jī)?nèi)，并使人工廢水中氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和正磷酸鹽磷的濃度分別為15.63±0.26mg／L、14.38±0.29mg／L、13.89±0.32mg／L和9.01±0.17mg／L.將三角瓶置于紫外消毒的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，并保持溫度為25±1℃和光照強(qiáng)度為8000lx的連續(xù)光照條件下，每隔24h取水樣測(cè)量廢水中殘留的氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的濃度，并計(jì)算出各形態(tài)氮的去除率，結(jié)果如圖1所示.

圖1 固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的去除（n＝3）

將固定化核蛋白小球藻投加到廢水中后，固定化材料和藻細(xì)胞對(duì)各種形態(tài)的氮均具有一個(gè)快速的吸附去除過(guò)程.由圖1可知，氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮在2h內(nèi)的初始吸附去除率分別為10.7%±0.6%、7.1%±0.6%和6.7%±0.1%.

由圖1可知，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，氨氮濃度在第1天即開(kāi)始顯著下降（p＜0.01），而亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度則分別在第3天和第4天才開(kāi)始顯著下降（p＜0.01）.由此可見(jiàn)，蛋白核小球藻首先吸收去除廢水中的氨氮，只有將氨氮消耗殆盡（殘留濃度小于1.67mg／L）后，才開(kāi)始快速吸收去除亞硝酸鹽氮（見(jiàn)圖1），當(dāng)亞硝酸鹽氮去除到一定水平后（小于5.92mg／L時(shí)），才開(kāi)始利用硝酸鹽氮.因此，固定化蛋白核小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的去除存在一定的先后順序，一般首先去除氨氮，其次為亞硝酸鹽氮，最后為硝酸鹽氮.

在為期5d的試驗(yàn)中，固定化蛋白核小球藻對(duì)各種形態(tài)氮的最終去除率存在較為顯著的差異（p＜0.01）.由圖1可知，氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的去除率分別為100%、79.2%±0.8%和61.2%±0.2%，這和其去除順序具有一定的正相關(guān)性.

在生物體內(nèi)，只有還原態(tài)的氨氮才能被整合到碳骨架上，形成生物生命活動(dòng)所必需的含氮化合物.因此，在生物對(duì)硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮利用的過(guò)程中，必須先將其還原成氨氮.然而，將硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氨氮的過(guò)程需要消耗能量和還原勢(shì)［14－16］，所以藻類(lèi)和其它光合微生物首先選擇氨氮作為氮源，并且若存在可利用的氨氮時(shí)，微藻的調(diào)節(jié)機(jī)制就會(huì)抑制其對(duì)其它氮源的同化吸收［17－18］，即核蛋白小球藻首先吸收去除氨氮.

雖然氨氮可以通過(guò)抑制其載體的活性及合成來(lái)抑制微藻對(duì)硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的吸收，但是亞硝酸鹽氮卻并不能抑制硝酸鹽氮的吸收［19］，例如生長(zhǎng)在高CO2分壓下的C.reinhardtii細(xì)胞，氨氮可以強(qiáng)烈抑制其對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽的利用，并且只有當(dāng)氨氮被完全去除后，C.reinhardtii才開(kāi)始同時(shí)去除硝酸鹽和亞硝酸鹽［19］.然而，在本試驗(yàn)中固定化蛋白核小球藻對(duì)亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的去除卻表現(xiàn)出一定的選擇性和先后順序（見(jiàn)圖1），這和Garbayo等［20］的研究結(jié)果類(lèi)似.

造成這種現(xiàn)象的原因可以從兩個(gè)方面進(jìn)行分析，即（1）固定化影響了微藻對(duì)不同形態(tài)氮的親和力（Ks）；（2）固定化強(qiáng)化了微藻的光呼吸.

（1）固定化對(duì)Ks的影響

在海藻酸鈣固定化C.reinhardtii中，盡管與懸浮細(xì)胞相比較，其對(duì)氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽的親和力都有所下降，但只有硝酸鹽的親和力下降最為明顯［20］.所以，固定化蛋白核小球藻首先去除亞硝酸鹽，然后才去除硝酸鹽.

（2）固定化對(duì)光呼吸的影響

Azuara等［21］認(rèn)為，在較高的光照強(qiáng)度下，Chlamydomonas能夠利用硝酸鹽或亞硝酸鹽光致產(chǎn)銨.而對(duì)固定化藻細(xì)胞而言，因?yàn)楣潭ɑ|(zhì)限制了O2等光合作用產(chǎn)物由內(nèi)到外的擴(kuò)散和CO2等光合作用原料由外到內(nèi)的擴(kuò)散，導(dǎo)致了凝膠小球內(nèi)藻細(xì)胞周?chē)鶲2／CO2比率的升高.較高的O2／CO2比率會(huì)增加光呼吸的活性，而光呼吸產(chǎn)生的光致產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致銨的局部積累現(xiàn)象.局部相對(duì)較高的銨會(huì)抑制固定化細(xì)胞對(duì)硝酸鹽的消耗，但不會(huì)影響亞硝酸鹽的吸收，所以固定化微藻優(yōu)先去除亞硝酸鹽.直到亞硝酸鹽降至某一濃度后（小于5.92mg／L）后，固定化細(xì)胞周?chē)e累的銨才會(huì)被迅速的同化掉，從而導(dǎo)致了硝酸鹽的最終去除［20］.

2.2 固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)磷的去除

將1200個(gè)初始藻密度為2.0×106藻細(xì)胞／球的凝膠小球投加到盛有300mL人工廢水的三角瓶?jī)?nèi)，并使人工廢水中氨氮、正磷酸鹽磷和六偏磷酸鈉磷的濃度分別為29.95±0.24mg／L、3.14±0.12mg／L和3.25±0.16mg／L.將三角瓶置于經(jīng)紫外線消毒的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，調(diào)節(jié)溫度至25±1℃，在光照強(qiáng)度為8000lx的連續(xù)光照條件下培養(yǎng)，每隔24h測(cè)量廢水中殘留的正磷酸鹽磷和總磷濃度.并據(jù)此計(jì)算出六偏磷酸鈉磷濃度，同時(shí)計(jì)算正磷酸鹽磷和六偏磷酸磷并計(jì)算去除率，結(jié)果如圖2所示.

因?yàn)楸狙芯恐兄苯訙y(cè)量得到的殘留正磷酸鹽濃度包括兩個(gè)方面的來(lái)源，即人工廢水中本身含有的磷酸二氫鉀和六偏磷酸鈉水解得到的正磷酸鹽，所以測(cè)得的正磷酸鹽磷去除量決定于微藻對(duì)正磷酸鹽的吸收和六偏磷酸鈉的水解這兩個(gè)方面.直接測(cè)量得到的殘留六偏磷酸鈉磷濃度是通過(guò)測(cè)量總磷的濃度和正磷酸鹽磷濃度，并用總磷濃度減去正磷酸鹽濃度得到的，所以固定化微藻對(duì)六偏磷酸鈉磷的去除包括其水解部分.

由圖2可知，和不同形態(tài)氮的結(jié)果類(lèi)似，固定化核蛋白小球藻對(duì)正磷酸鹽磷和六偏磷酸磷具有初始吸附去除率，但是因?yàn)樵诔跗谖皆囼?yàn)中，廢水的pH值相對(duì)較低（7.0左右），六偏磷酸鈉較易發(fā)生水解并生成正磷酸鹽，從而導(dǎo)致了六偏磷酸鈉磷較大（達(dá)17.3%±1.9%）的初期去除率和正磷酸鹽磷較?。▋H1.9%±1.2%）的初期去除率.

圖2 固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)磷的去除（n＝3）

在試驗(yàn)剛剛開(kāi)始時(shí)，由于藻類(lèi)通過(guò)光合作用固定水中的CO2等溶解性無(wú)機(jī)碳（DIC）而導(dǎo)致的廢水pH值升高并不是很明顯，六偏磷酸鈉的水解速度相對(duì)較快，所以在試驗(yàn)第1天，六偏磷酸鈉的去除率顯著增加（p＜0.01），達(dá)17.2%（如圖2所示）.與此相對(duì)應(yīng)，由于六偏磷酸鈉水解生成正磷酸鹽，所以正磷酸鹽磷的去除量和去除率相對(duì)較?。ㄈ鐖D2所示）.

隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，核蛋白小球藻通過(guò)光合作用固定水中的CO2等DIC，導(dǎo)致廢水的pH值升高，六偏磷酸鈉的水解速率下降.并且，微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中一般同化吸收正磷酸鹽，而聚磷酸鹽則必須被水解為正磷酸鹽后才能被同化［22］，所以在試驗(yàn)的第2天六偏磷酸鈉磷的去除率無(wú)顯著變化（p＞0.01）.當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行到第3天時(shí)，正磷酸鹽磷已經(jīng)被消耗殆盡（僅剩0.96±0.11mg／L），微藻為了維持較快的生長(zhǎng)速率，開(kāi)始大量合成聚磷酸鹽水解酶以利用六偏磷酸鈉磷，所以從第3天開(kāi)始，六偏磷酸鈉磷的去除率增加量開(kāi)始顯著變大（見(jiàn)圖2）.

3 結(jié)論

（1）固定化核蛋白小球藻對(duì)人工廢水中不同形態(tài)的氮和磷的去除具有選擇性.

（2）固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的去除順序?yàn)榘钡?、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，在為期5天的試驗(yàn)中去除率分別為100%、79.2%±0.8%和61.2%±0.2%.

（3）固定化核蛋白小球藻對(duì)不同形態(tài)磷的去除順序?yàn)檎姿猁}磷和六偏磷酸鹽磷，在為期4天的試驗(yàn)中去除率分別為71.4%±1.6%和80.3%±1.0%.

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