多環(huán)芳烴——萘對褶皺臂尾輪蟲生長的影響

周 晶，王仁君，沙未來，孟榮江，陳富杰

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

在整個動物界中，輪蟲門是世界性廣泛分布的重要海洋浮游動物類群之一，雖然屬于一個很小的門類［1］，但因為其在水環(huán)境中的重要作用而備受重視.它們分布廣泛，是后生動物中擁有最高繁殖速率的類群.能夠極其迅速地搶占生態(tài)系統(tǒng)中空的生態(tài)位并將初級生產(chǎn)量（藻類和細菌等）轉換成可被次級消費者（昆蟲、甲殼動物和魚類幼苗）利用的有機物，其轉換效率極高，由它所轉換的生物量可占總浮游生物現(xiàn)存量的30%左右.

盡管它個體小，生物量也不是很高，但由于發(fā)育時間短、周轉快，故其生產(chǎn)量仍較高.因而它在水體生態(tài)系統(tǒng)的結構、組成、物質循環(huán)和能量傳遞等過程中具有重要意義［1－3］.輪蟲還具有游泳速度慢、繁殖迅速、營養(yǎng)豐富、易培養(yǎng)以及不污染水質等特點，因此是蝦蟹以及魚類等水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼苗的理想可口飼料和優(yōu)質食物，在漁業(yè)生產(chǎn)中有很大的應用價值.同時它也是一類很好的指示生物，在環(huán)境監(jiān)測和生態(tài)毒理研究中被廣泛采用［4－5］.目前，國內外對輪蟲的研究主要都集中在培養(yǎng)技術、餌料生物的餌料效果、急性毒性實驗、種群數(shù)量和實驗種群動態(tài)等方面，而多環(huán)芳烴對輪蟲生長發(fā)育的影響較少.

目前，環(huán)境與人類健康密切相關［6］.多環(huán)芳烴是一類重要的全球性污染物，是美國環(huán)保局制定的129種優(yōu)先污染物中的一類，它廣泛存在于人類生活的自然環(huán)境如大氣、水體、土壤、作物和食品中.萘是含有兩個苯環(huán)的最簡單的芳香化合物，雖然它在水中的溶解度較小，水體中含量通常較低，但由于多環(huán)芳烴易于從水體中分回到沉積物中，使沉積物中該類化合物的含量較高.又由于其脂溶性強，被攝入動物體內后即溶于脂肪，很難分解排泄.通過生物富集作用，使食物鏈上高營養(yǎng)級生物機體中這種物質的含量顯著超過水中的含量，有的濃度成千上萬倍增加，威脅人類健康［7－9］.

浮游動物是海洋牧食食物鏈的重要組成部分，在海洋食物鏈中起著承前啟后的關鍵作用［10－11］.本文開展了多環(huán)芳烴——萘對海洋常見種類褶皺臂尾輪蟲（B.plicatilis）的生長發(fā)育方面的研究，一方面為我國輪蟲培育的研究提供基礎資料，另一方面，為深入開展多環(huán)芳烴對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供一些科學依據(jù)［12］.

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源和預培養(yǎng)

褶皺臂尾輪蟲系在21～25℃下，以選用中國海洋大學水產(chǎn)學院微藻種質庫（MACC）提供的小球藻（Chlorella s p.）為食物，在鹽度為10‰的半咸水中保存下的種［13］；光照為自然光.

1.2 多環(huán)芳烴化合物——萘

萘，AR，上?；瘜W試劑采購供應站；丙酮，AR，上海菲達工貿有限公司和橋分公司.

1.3 不同濃度萘溶液的配置

25℃時萘在水中的溶解度為38.5mg·L－1.由于萘為片狀晶體結構，直接介入水進行攪拌不易溶解，濃度最高達10mg／L左右，本實驗采用先將萘溶于丙酮配制成濃度為1g·L－1母液，避光于4℃下保存.在預實驗的基礎上用海水進行不同倍數(shù)的稀釋，最終配制出5mg·L－1、2.5mg·L－1、2mg·L－1、1mg·L－1、0.5mg·L－1、0.1mg·L－1六個濃度梯度的溶液，避光于4℃下保存以備實驗用［14］.

1.4 單個體培養(yǎng)

實驗在容積為15mL的6孔凹槽培養(yǎng)板中進行，培養(yǎng)液體積4mL.首先從預培養(yǎng)的輪蟲中挑選足量活潑健壯的攜非混交卵雌體進行培養(yǎng)，收集同步孵化的輪蟲幼體，并將其放入實驗用培養(yǎng)板中，每孔1個，每個濃度設置3個培養(yǎng)板.

1.5 多環(huán)芳烴——萘的毒性實驗

分別向實驗用多空培養(yǎng)板中滴加2mL一定濃度的萘溶液，每一個濃度梯度做三個平行，同時做一組只加入海水的空白對照，然后將收集到的同步孵化的輪蟲幼體放入裝有一定濃度萘溶液的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，在解剖鏡下觀察，開始記錄觀察結果.不觀察時將培養(yǎng)扳的蓋子蓋上，以防水分蒸發(fā)從而造成鹽度升高，并置于恒溫箱中培養(yǎng)，21～25℃下，小球藻（Chlorella s p.）為食物，在鹽度為10‰的半咸水中保存下的種［13］；光照為自然光.

每個個體每隔一段時間觀察一次，準確記錄輪蟲產(chǎn)第一枚卵以及卵孵化出第一個幼體的時間，并記錄輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)、孵化出的幼體數(shù)和母體存活情況，并移去幼體.實驗至全部個體死亡時為止.在經(jīng)過萘處理后的培養(yǎng)過程中要定時、定量向實驗物中滴加萘溶液，以防止萘揮發(fā)光解而造成萘濃度下降.在實驗期間投以1×106細胞·mL－1的小球藻為餌料，隔24h投喂一次.

1.6 研究參數(shù)的定義及計算方法

各主要發(fā)育階段的歷時:

（1）胚胎發(fā)育期 即卵的發(fā)育時間，指從卵的產(chǎn)出到幼體孵出所經(jīng)歷的時間；

（2）生殖前期 又稱幼體階段或胚后發(fā)育，從幼體孵出到其產(chǎn)出第一枚卵所經(jīng)歷的時間；

（3）生殖期 指從第一枚卵產(chǎn)出到最后一枚卵產(chǎn)出所經(jīng)歷的時間；

（4）生殖后期 又稱衰老期（senility phase），指從輪蟲產(chǎn)出最后一枚卵到其死亡所經(jīng)歷的時間；

（5）最小世代時間 為胚胎發(fā)育時間與幼體階段歷時之和.

以上個體發(fā)育階段的歷時以及輪蟲的平均壽命和其一生中的產(chǎn)卵量均按實際觀察值平均求得.

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS 19.0進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準誤差（Mean±SE）表示，兩組間數(shù)據(jù)應用配對t檢驗進行差異分析.

2 實驗結果與分析

2.1 不同濃度的萘對褶皺臂尾輪蟲存活時間和繁殖量的影響

經(jīng)7種不同濃度的萘溶液處理下輪蟲存活時間即平均壽命和繁殖量即平均產(chǎn)卵量結果見表1，分析結果如圖1、2所示.

圖1 輪蟲平均壽命示意圖

圖2 輪蟲平均產(chǎn)卵量示意圖

單因素方差分析表明，在本實驗條件下，與對照組相比，不同萘的濃度對褶皺臂尾輪蟲的平均壽命和產(chǎn)卵量均有顯著影響（P＜0.05）.由圖1、2可知，低濃度萘溶液會抑制輪蟲的存活壽命和產(chǎn)卵量，在濃度為1mg·L－1時抑制作用強度達到最高，存活壽命和產(chǎn)卵量均最低，存活時間為116h，產(chǎn)卵量為2個；而高濃度萘溶液表現(xiàn)為回復作用，平均壽命慢慢趨向于正常培養(yǎng)條件下的平均壽命，但刺激其產(chǎn)卵，以濃度為2mg·L－1萘溶液處理組的刺激作用最強，存活時間為496.14h，產(chǎn)卵量為18個.低濃度（小于1mg·L－1）刺激下輪蟲的產(chǎn)卵量與正常培養(yǎng)條件下變化起伏不很大，而高濃度（大于2mg·L－1）條件下，輪蟲的產(chǎn)卵量明顯高于正常培養(yǎng)條件下的產(chǎn)卵量.而對于平均壽命則沒有表現(xiàn)出這種規(guī)律，高、低濃度刺激下平均壽命較正常培養(yǎng)條件下變化起伏均較大.

2.2 臂尾輪蟲主要發(fā)育階段歷時和產(chǎn)卵量的影響

經(jīng)7種不同濃度的萘溶液處理下輪蟲各主要發(fā)育階段歷時和產(chǎn)卵量見表1.

圖3 各生長發(fā)育期歷時對比示意圖

經(jīng)不同濃度萘溶液處理下的輪蟲各生長發(fā)育階段的歷時如圖3所示.由圖3可以看出，隨著萘溶液濃度的增加，生殖期歷時變化表現(xiàn)的最為明顯，先縮短后又延長，即低計量刺激生殖期的發(fā)育，在萘濃度為1mg·L－1時歷時達到最低，為10h，而后隨著萘濃度（2mg·L－1、2.5mg·L－1）增強，生殖期歷時開始增加，即抑制輪蟲的生殖期，使生殖期歷時恢復到在正常培養(yǎng)條件下輪蟲的生殖期歷時.當萘溶液濃度繼續(xù)增加即達到5mg·L－1時，生殖期歷時開始超過正常培養(yǎng)條件下的時間，即延長了生殖期.最小世代期歷時隨著萘溶液濃度增加的變化趨勢與生殖期的變化趨勢大體一致，但變化起伏較生殖期小，而且，萘溶液始終表現(xiàn)為刺激了它的最小世代期發(fā)育期，即在最高濃度下，輪蟲的最小世代期歷時仍小于在正常培養(yǎng)條件下的歷時.在不同濃度萘溶液培養(yǎng)下，輪蟲的胚胎發(fā)育期歷時均小于在正常海水培養(yǎng)下輪蟲的胚胎發(fā)育期，曲線起伏變化不大，由此可大體可確定多環(huán)芳烴萘不同程度的刺激了輪蟲的胚胎發(fā)育期發(fā)育.生殖后期受萘溶液影響變化起伏較大，沒有很明顯的規(guī)律，但總體看來，輪蟲的生殖后期在正常海水條件下的歷時均要長于在不同濃度萘溶液培養(yǎng)條件下的歷時，即可大體認為萘縮減了輪蟲的生殖后期歷時，即也表現(xiàn)為刺激效應。生殖前期在萘濃度為1mg·L－1時歷時最短，達到一個最小的峰值，小于正常培養(yǎng)條件下的歷時，在萘濃度為0.5mg·L－1之前和濃度2mg·L－1之后均變化不大，即表現(xiàn)為緩慢下降和緩慢上升，但都高于正常培養(yǎng)條件下的歷時，即在這兩個范圍內，萘起了抑制其發(fā)育的作用，延長了輪蟲的生長前期，但變化不大。

表1 不同濃度萘溶液培養(yǎng)時壺狀臂尾輪蟲各主要發(fā)育階段的歷時（小時）和產(chǎn)卵量（個）

3 討論

3.1 不同濃度萘對褶皺臂尾輪蟲存活壽命和產(chǎn)卵量的效應

不同濃度的萘溶液明顯的影響了輪蟲的平均壽命和產(chǎn)卵量，總體趨勢大體均表現(xiàn)為先抑制后回復，且在萘溶液濃度為1mg·L－1時抑制作用達到最強，存活壽命降低至116h，產(chǎn)卵量降至2個。在濃度為2 mg·L－1時表現(xiàn)為刺激作用，且達到最強，平均存活壽命達到469.14h，產(chǎn)卵量高達18個。濃度再升高對于平均壽命便趨向于回復作用，即回復到正常培養(yǎng)條件的平均壽命；對于平均產(chǎn)卵量依然表現(xiàn)為刺激作用，但強度低于濃度為2mg·L－1時的刺激作用。

具體來說，對于平均壽命，低濃度（0.1mg·L－1、0.5mg·L－1、1mg·L－1）嚴重縮短了了輪蟲的平均壽命，濃度升高，抑制作用減小，平均壽命開始明顯增加，當濃度達到2mg·L－1時表現(xiàn)為刺激作用最強，輪蟲的平均壽命超過正常培養(yǎng)條件下的壽命，而隨后，隨萘濃度的再增加，表現(xiàn)為回復作用，平均壽命又有了下降的趨勢，但降幅不大，慢慢趨向于正常培養(yǎng)條件下的平均壽命。當濃度達到5mg·L－1時，輪蟲的平均壽命雖然仍低于正常條件下的值，但又有增加的趨勢，即在正常培養(yǎng)條件下的平均壽命值附近上下波動。

對于產(chǎn)卵量，低濃度（小于1mg·L－1）萘溶液培養(yǎng)時，輪蟲的產(chǎn)卵量表現(xiàn)出明顯依次的遞減規(guī)律，即對輪蟲產(chǎn)卵有明顯的抑制作用，而后表現(xiàn)為強烈的刺激作用。在濃度為2mg·L－1時，刺激作用達到最強，平均產(chǎn)卵量高達18個，隨著濃度的增加，產(chǎn)卵量有所下降，但仍高于正常培養(yǎng)條件下的產(chǎn)卵量，即高濃度萘溶液對輪蟲產(chǎn)卵有刺激作用，刺激其產(chǎn)卵，增加其產(chǎn)卵量。

3.2 不同濃度萘對褶皺臂尾輪蟲生長發(fā)育的刺激效應

總體來說，不同濃度的多環(huán)芳烴萘溶液對輪蟲生長發(fā)育5個時期的歷時影響較復雜，對各個時期的發(fā)育影響均不同。但有一個明顯的共同點是，在萘溶液濃度為1mg·L－1時，輪蟲的5個發(fā)育期歷時均有明顯的轉折。生殖前期、生殖期和最小世代期均在此點前后表現(xiàn)為明顯的刺激和抑制作用，生殖后期在一個小濃度范圍（0.5mg·L－1－2mg·L－1）內，在此點兩側分別表現(xiàn)為明顯的刺激和抑制，胚胎發(fā)育期在總體抑制的大趨勢下在此點兩側也分別表現(xiàn)為抑制和刺激作用。

影響最明顯的為輪蟲的生殖期，低濃度（濃度低于1mg·L－1）表現(xiàn)為明顯的刺激發(fā)育的作用、高濃度（濃度高于2.5mg·L－1）表現(xiàn)為強烈的抑制發(fā)育的作用，在濃度為0.1mg·L－1時刺激作用達到最強，生殖期最短降低至45h，1.0mg·L－1～2.5mg·L－1濃度區(qū)間為輪蟲生殖期的恢復期，生殖期歷時基本恢復到了輪蟲正常培養(yǎng)條件下的時間。

在本實驗設置的濃度條件下，最小世代歷時均小于正常培養(yǎng)條件下的歷時，表現(xiàn)為萘刺激了輪蟲的發(fā)育，縮短了最小世代時間，但由圖我們可以發(fā)現(xiàn)仍有向上增長的趨勢，但增長趨勢緩慢，所以總體仍表現(xiàn)為刺激發(fā)育的作用，隨濃度不同強度強度不同。

在不同萘溶液條件培養(yǎng)下，生殖前期的總體趨勢表現(xiàn)為先抑制、后刺激、再抑制。在萘溶液濃度為0.5mg·L－1－2.0mg·L－1范圍內表現(xiàn)為強烈的刺激發(fā)育作用，歷時明顯低于正常培養(yǎng)條件下的時間，而在此濃度之外的區(qū)間內表現(xiàn)為抑制發(fā)育作用，延長了它的生殖前期歷時，超過了正常培養(yǎng)條件下的歷時，但作用不很明顯。

胚胎發(fā)育期明顯低于正常培養(yǎng)條件下的歷時，說明不同濃度的萘溶液會不同程度的縮短輪蟲的胚胎發(fā)育期，在濃度為1mg·L－1時對輪蟲的刺激發(fā)育作用最小，與正常培養(yǎng)條件下的歷時相差最小。

變化最大最沒有規(guī)律性的是輪蟲的生殖后期，又稱衰老期，由于個體差異及前期個體各發(fā)育階段的不同、對外界條件適應程度的不同導致了結果的無明顯規(guī)律性，各濃度變化對輪蟲這一時期的影響均較大，但總體表現(xiàn)出萘溶液縮減了輪蟲的生殖后期，加速了它的死亡。

3.3 萘對褶皺臂尾輪蟲生長發(fā)育影響的原因分析

目前的研究表明，萘對浮游動物的影響顯出較大的差異和種的特異性。有些浮游動物對萘保持著較高的攝食率并沒有出現(xiàn)明顯的生理上的影響。相反，也有研究證實萘能夠降低浮游動物的攝食率、產(chǎn)卵率和卵的孵化率，甚至導致麻痹和死亡［15］。本實驗所研究的不同濃度的萘對褶皺臂尾輪蟲的影響，很可能是萘被攝食到輪蟲體內后影響了消化或者由于體內需要降解有害物質而消耗能量使得其他方面的的可利用能量減少，對輪蟲的生理機能造成了影響。這些影響因素的作用最終導致了輪蟲平均壽命的縮短和世代時間的延長，產(chǎn)卵量、凈生殖率下降。這也可能造成輪蟲種群增長降低的主要原因，具體的毒性機理有待進一步研究。

本實驗結果表明，不同萘濃度對褶皺臂尾輪蟲產(chǎn)生了不利影響，使其凈生殖率和壽命下降。研究表明，浮游動物種群對有害多環(huán)芳烴的長期性暴露和進化抵抗力是決定有害物質是否對其產(chǎn)生危害和不利影響的重要因素［16］。同時，被萘污染的藻類對浮游動物的攝食、繁殖和生長液產(chǎn)生了直接或間接的影響，從而造成了浮游生物在食物鏈中物質和能量的傳遞、流動的障礙。因此，有害多環(huán)芳烴和浮游動物關系的進一步研究對于我們了解其對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響和作用機制具有重要意義。

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