羅漢果葉不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除作用研究Δ

楊艷芳，朱艷平，肖夢媛，陳清杰，吳和珍1，#（1.湖北中醫(yī)藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室，武漢 430065；.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，武漢 430065）

羅漢果Siraitia grosvenorii.為葫蘆科多年生宿根草質(zhì)藤本植物，盛產(chǎn)于廣西，為藥食兩用植物。藥用果實收載于2010年版《中國藥典》（一部），具有清熱潤肺、利咽開音、潤腸通便的功能，臨床用于肺熱燥咳，咽痛失音，腸燥便秘的治療[1]。最近研究表明，羅漢果具有抗氧化、抗糖尿病和抗癌的功效[2，3]。為了挖掘羅漢果潛在的藥用價值，探討羅漢果發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組前期已研究了羅漢果植株的莖、葉和果實的抗氧化活性，其中葉的抗氧化活性最佳[4]，因此繼續(xù)對羅漢果葉抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)進行了深入研究，采用二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基體系法，測定羅漢果葉不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2401型紫外-可見分光光度計（日本Madzu公司）；HH-2型顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SY-1000型超聲提取機（北京弘祥隆生物技術(shù)有限公司）；BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

羅漢果2010年6月采自廣西龍勝縣和平鄉(xiāng)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學生藥學教研室吳和珍教授鑒定為真品。DPPH（美國Sigma公司，批號：STBB 0510）；沒食子酸（天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心，批號：20100110）；抗壞血酸（湖南省婁底市湘大化工試劑有限公司，批號：20100422）；乙醇（上海振興化工一廠，批號：200908304）；石油醚（批號：20090815）、乙酸乙酯（批號：20100607）均購自天津市永大化學試劑開發(fā)中心；正丁醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20091124）；水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備

[4]，精密稱取羅漢果葉粉末（過60目篩）10g，置于100mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，超聲提?。üβ剩?50W，頻率：40KHz）30min，放冷，濾過。濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水混懸，得羅漢果葉提取物溶液。該溶液依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4種提取物，揮干溶劑，稱定浸膏重量，以乙醇為溶劑，依次配成不同濃度的羅漢果葉不同溶劑提取物溶液，貯藏，備用。配制DPPH溶液置于4℃冰箱貯藏，備用。并以乙醇為溶劑，將沒食子酸和抗壞血酸配成不同濃度的溶液，測定其抗氧化能力。

2.2 DPPH溶液穩(wěn)定性試驗

在DPPH溶劑中加入羅漢果葉提取物溶液后，測定吸光度（A）與時間（t）關(guān)系。A值在最初20min內(nèi)下降較快；在20～40min內(nèi)，反應體系的A值變化緩慢；50min后A值基本保持不變。故測定時選擇DPPH與羅漢果葉提取物反應時間為50min。樣品與自由基DPPH反應時間曲線見圖1。

圖1 樣品與自由基DPPH反應時間曲線Fig 1 Response time curves of sample with free radical DPPH

2.3 羅漢果葉不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力的測定

采用DPPH自由基體系法對羅漢果葉不同溶劑提取物進行了測定，結(jié)果各溶劑提取物都具有一定的抗氧化作用。羅漢果葉不同溶劑提取物濃度與DPPH自由基的清除關(guān)系見圖2。

圖2 羅漢果葉不同溶劑提取物濃度與DPPH自由基的清除關(guān)系Fig 2Relation of the extracts of the leaf of S.grosvenorii with free radical DPPH scavenging

測定羅漢果葉石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為 16.250、0.554、0.596、0.267mg·mL－1。可見，羅漢果葉不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力的大小順序為：水提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物。

2.4 抗氧化劑清除DPPH自由基能力的測定

抗壞血酸、沒食子酸是常見的抗氧化劑，采用DPPH自由基體系法測定其抗氧化能力?？箟难帷]食子酸的IC50值分別為0.00223、0.00084mg（生藥）·mL－1，沒食子酸清除DPPH自由基能力大于抗壞血酸。抗氧化劑濃度與DPPH自由基的清除關(guān)系見圖3。

2.5 羅漢果葉不同溶劑提取物與抗氧化劑對DPPH自由基清除作用的比較

羅漢果葉不同溶劑提取物清除DPPH自由基的能力與抗壞血酸、沒食子酸比較，當水提取物濃度達到2mg·mL－1時，其清除自由基能力與抗壞血酸、沒食子酸相當。羅漢果葉不同溶劑提取物與抗氧化劑對DPPH自由基的清除率見表1。

3 討論

本研究測定了羅漢果葉不同溶劑提取物清除DPPH自由基的能力。結(jié)果表明，羅漢果葉石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物的IC50值分別為16.250、0.554、0.596、0.267mg（生藥）·mL－1，各提取物均具有抗氧化活性，其中水提取物的抗氧化活性最強；與沒食子酸、抗壞血酸對DPPH自由基清除率比較，當羅漢果葉水提取物濃度達到2mg·mL－1時，其清除DPPH自由基能力與二者相當。本研究結(jié)果可為羅漢果的綜合開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：197.

[2] 王 勤，覃洪含，王 巍，等.羅漢果藥理研究進展[J].廣西中醫(yī)學院學報，2010，13（3）：75.

[3] 肖 剛，王 勤.羅漢果甜苷對小鼠實驗性肝損傷保護作用的研究[J].中國藥房，2008，19（3）：163.

[4] 吳和珍，朱艷平，楊艷芳，等.羅漢果植株不同器官的抗氧化活性[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（4）：176.