梗脈通顆粒的毒理學實驗研究

孫麗紅，孫兆榮，盧貞（1.山東省泰安榮軍醫(yī)院，山東泰安71000；.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東泰安71000）

梗脈通顆粒處方是山東省泰安榮軍醫(yī)院老年病科的協(xié)定方。方中含有三七、葛根、銀杏葉、川芎、羌活等藥材，具有活血化瘀、通脈活絡(luò)的功效，臨床主要用于腦脈瘀阻、中風偏癱、腦供血不足、腦動脈硬化等缺血性腦病的治療。臨床應(yīng)用多年，療效顯著。為方便臨床用藥，筆者在此方劑基礎(chǔ)上將煎劑研制成顆粒劑[1]。為保證臨床用藥的安全性，筆者對梗脈通顆粒進行了毒理學研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

枸櫞酸鈉靜脈采血管、普通生化類靜脈采血管（廣州威佳科技有限公司）；BS110S型電子天平（德國SartoriusAG公司）；Leica RM2135型切片機（德國Laica公司）；BH-2型顯微鏡、AU600型全自動生化分析儀（日本Olympus公司）；CEUDYN3500R型全自動血液分析儀（美國Abbot公司）。

1.2 試藥

梗脈通顆粒（山東省泰安榮軍醫(yī)院制劑室提供，批號：100313，1g含生藥1.667g），實驗前用純化水配成不同濃度的梗脈通溶液，備用；血液記數(shù)儀試劑（濟南深藍科貿(mào)有限公司）；生化試劑（北京中生生物工程技術(shù)公司）；凝血酶時間、凝血酶原時間試劑（上海太陽生物技術(shù)公司）。

1.3 動物

昆明種小鼠30只，♀♂兼半，體重18～22g；Wistar大鼠80只，6月齡，♀♂兼半，♀體重90～110g，♂體重100～120g，均由山東大學實驗動物中心提供（動物使用合格證號：SCXK（魯）20090001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 急性毒性試驗[2，3]

2.1.1 預試驗 10只小鼠（♀♂兼半）ig 60%梗脈通溶液0.4mL·10g－1，觀察24h小鼠的一般活動情況與死亡數(shù)。結(jié)果，小鼠無一死亡，表明均無中毒表現(xiàn)，故難以測定本品半數(shù)死亡劑量（LD50）。

2.1.2 最大耐受量測定 實驗分為2組，即實驗（60%梗脈通0.4mL·10g－1）、對照（等容生理鹽水）組。每組小鼠♀♂各5只，禁食12h后稱重，ig給藥，每天3次，每次間隔6h，每天給生藥量達120g·kg－1，連續(xù)7d。觀察指標：給藥前、后的體重，進食、進水情況，密切觀察異常毒性癥狀，包括行動、神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)，自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)，死亡情況。結(jié)果，實驗組24h內(nèi)均未出現(xiàn)稀便，大便成型。7d內(nèi)，2組小鼠進食、活動均無異常，各種反射正常，無一小鼠死亡，第7日斷食12h再次稱重，2組小鼠體重比較無顯著性差異，表明小鼠ig生藥量120g·kg－1時對小鼠無明顯急性毒性作用。梗脈通顆粒對小鼠體重的影響見表1。

表1 梗脈通顆粒對小鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effects of Gengmaitong granules on body weight of mic（e±s，n＝10）

表1 梗脈通顆粒對小鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effects of Gengmaitong granules on body weight of mic（e±s，n＝10）

組別實驗組對照組給藥前體重/g 19.65±1.1319.65±1.08藥后7d體重/g 22.32±1.6722.51±1.81

2.2 長期毒性試驗[2，3]

2.2.1 梗脈通顆粒對大鼠一般行為活動、外觀體征、形態(tài)等影響 實驗分成4組，即對照（等容生理鹽水）和梗脈通顆粒高、中、低劑量（35.70、7.14、3.57g·kg－1，分別相當于70kg成人臨床日用量的100、20、10倍）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)90d，結(jié)束給藥后進行2周的恢復性觀察。觀察大鼠外觀體征、尿與糞便性狀等，并隨時記錄異常變化。給藥前、給藥后90d內(nèi)與整個恢復性觀察期間，各組大鼠生長發(fā)育正常，被毛理順光滑，眼睛明亮有神，反應(yīng)機敏，呼吸平穩(wěn)，飲食正常，大便無稀溏，無嘔吐、無流涎，自發(fā)活動正常，未見異常表現(xiàn)。結(jié)果表明，長期連續(xù)90d ig梗脈通顆粒35.70、7.14、3.57g·kg－1對♀♂大鼠行為活動、外觀體征等無不良影響。

2.2.2 梗脈通顆粒對大鼠體重的影響 每周稱量1次大鼠體重，并根據(jù)體重的變化，重新計算給藥量。給藥前、給藥后90d內(nèi)與整個恢復性觀察期間梗脈通顆粒高、中、低劑量組♀♂大鼠體重增長正常，與對照組比較無顯著性差異。結(jié)果表明，長期連續(xù)90d ig梗脈通顆粒對大鼠體重無不良影響，停藥恢復期無延遲性毒性反應(yīng)。梗脈通顆粒對大鼠體重的影響見表2。

表2 梗脈通顆粒對大鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 2Effects of Gengmaitong granules on body weight of rats（±s，n＝10）

表2 梗脈通顆粒對大鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 2Effects of Gengmaitong granules on body weight of rats（±s，n＝10）

用藥時間給藥前1周2周3周4周5周6周7周8周9周10周11周12周90天恢復期1周恢復期2周梗脈通顆粒高劑量組對照組♀105.30±6.04117.56±7.14151.31±10.75167.95±12.78197.94±23.78232.75±20.34262.71±25.84294.56±26.04316.22±29.68333.76±31.51347.39±33.14355.23±34.54356.94±40.61365.48±38.86371.64±41.23404.12±43.26梗脈通顆粒低劑量♂♂梗脈通顆粒中劑量♀105.20±6.13113.62±6.81145.73±12.96165.20±13.82193.84±14.63227.60±24.83254.53±27.36286.36±25.64312.87±34.65326.40±33.76338.38±33.92349.62±33.63361.41±33.15366.61±33.14373.64±40.23406.25±39.87♂♂95.04±5.31111.71±7.95131.20±9.74148.21±10.14175.25±15.36202.84±19.71219.95±20.15241.45±22.16255.95±28.74267.22±23.37275.84±23.81282.31±23.96294.11±32.78286.70±20.81301.64±41.13344.12±45.26♀104.70±6.27113.65±7.68149.47±11.98166.15±14.06201.57±21.56236.51±23.74264.60±26.46289.06±27.81311.84±29.67327.38±34.13342.63±36.14350.33±34.71354.32±41.32355.04±46.51369.32±38.77402.56±40.3996.65±6.97111.05±7.13130.53±11.54150.15±8.29176.34±15.93200.11±18.17220.17±18.11236.50±19.89252.53±20.98262.72±21.28272.13±22.47280.52±22.24287.55±22.37288.92±23.63309.32±36.74352.56±47.4996.47±6.14106.81±5.71129.33±13.82144.78±12.90169.54±23.35197.80±18.21216.67±20.81239.47±24.31255.00±26.74265.80±27.90276.33±28.31284.54±30.39288.47±28.99293.53±29.12313.64±42.23356.35±49.85♀103.98±6.17113.53±7.64144.62±13.21169.01±11.84196.15±22.46225.13±25.65262.40±31.23290.00±0.18314.72±31.86330.15±33.08354.05±33.06359.31±32.08367.14±25.69376.76±41.24381.49±39.88412.31±43.5496.05±6.31106.80±7.29130.04±14.66147.27±10.52174.10±13.86195.16±16.76213.93±26.01238.77±30.09253.87±34.85270.33±28.39280.20±34.10288.31±36.08297.50±42.37288.00±41.21308.49±37.81350.31±41.54

2.2.3 血液常規(guī)、凝血系統(tǒng)、血液生化學指標檢測結(jié)果 于給藥后90d、恢復觀察期末解剖前經(jīng)頸靜脈采血，進行血常規(guī)、白細胞分類、凝血酶時間（TT）、凝血酶原時間（PT）、血液生化學指標的檢測。結(jié)果，給藥后第90天與恢復觀察期末，梗脈通顆粒高、中、低劑量組♀♂大鼠紅細胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（PLT）、白細胞（WBC）與淋巴細胞（LYM）、中間細胞（MID）、粒細胞（GRA）等值均在正常范圍內(nèi)，與對照組比較無顯著性差異。梗脈通顆粒對大鼠血液常規(guī)指標的影響見表3。

±s，n＝10）Tab 3 Effects of Gengmaitong granules on blood cytology indexes of rats（表3 梗脈通顆粒對大鼠血液常規(guī)指標的影響（±s，n＝10）

±s，n＝10）Tab 3 Effects of Gengmaitong granules on blood cytology indexes of rats（表3 梗脈通顆粒對大鼠血液常規(guī)指標的影響（±s，n＝10）

時間用藥90d后停藥2周后組別對照組梗脈通顆粒高劑量梗脈通顆粒中劑量梗脈通顆粒低劑量對照組梗脈通顆粒高劑量梗脈通顆粒中劑量梗脈通顆粒低劑量R BC/1012·L－1 7.24±0.447.38±0.867.31±0.577.34±0.627.22±0.447.34±0.817.56±0.547.89±0.52H b/g·L－1 155.9±4.2157.5±4.1156.3±3.7156.1±4.2156.3±4.2157.1±3.1158.4±2.7161.1±3.8PLT/109·L－1 766.5±89.2745.4±47.7729.6±32.7758.5±41.7763.5±69.3743.3±46.8731.6±31.3757.5±40.9W BC/109·L－1 10.35±2.6611.02±2.1411.25±1.1710.68±2.0310.84±2.7611.12±2.1411.26±1.0710.71±2.03LYM/109·L－1 6.48±3.126.87±3.246.95±3.196.54±3.116.56±3.026.91±3.246.94±3.396.58±2.91M ID/109·L－1 0.94±0.370.89±0.270.97±0.190.97±0.210.93±0.470.92±0.270.96±0.180.98±1.15G R A/109·L－1 2.93±1.563.26±1.143.33±1.743.17±1.153.50±1.263.29±1.243.36±1.643.15±1.15

用藥90d后，梗脈通顆粒高、中、低劑量組大鼠TT、PT與對照組比較顯著延長（P＜0.01或P＜0.05）?；謴推诠Ｃ}通顆粒高、中、低劑量組大鼠TT、PT均在正常范圍內(nèi)，與對照組比較無顯著性差異。梗脈通顆粒對大鼠凝血時間的影響見表4。

表4 梗脈通顆粒對大鼠凝血時間的影響（±s）Tab 4 Effects of Gengmaitong granules on coagulation time of rats（±s）

表4 梗脈通顆粒對大鼠凝血時間的影響（±s）Tab 4 Effects of Gengmaitong granules on coagulation time of rats（±s）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

PT 13.12±1.1317.12±1.5415.13±7.2114.17±2.46組別對照組梗脈通顆粒高劑量組梗脈通顆粒中劑量組梗脈通顆粒低劑量組用藥90d后T T 26.91±22.8145.89±17.74＊＊39.56±11.74＊＊34.24±13.34＊PT 12.44±2.6431.16±9.64＊＊27.63±8.41＊＊19.87±2.38＊停藥2周后T T 27.23±4.8730.93±12.3425.17±10.5424.31±11.14

用藥90d與停藥2周后，梗脈通顆粒高、中、低劑量組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（T-Bil）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、葡萄糖（GLU）、總膽固醇（CHO）等血液生化學指標與對照組比較無顯著性差異。梗脈通顆粒對大鼠血液生化學的影響分別見表5、表6。

表5 梗脈通顆粒對大鼠血液ALT、AST、ALP、GLU、BUN影響（±s）Tab 5 Effects of Gengmaitong granules on ALT，AST，ALP，GLU and BUN of rats（±s）

表5 梗脈通顆粒對大鼠血液ALT、AST、ALP、GLU、BUN影響（±s）Tab 5 Effects of Gengmaitong granules on ALT，AST，ALP，GLU and BUN of rats（±s）

用藥時間90d后停藥2周后A LT/U·L－1 56.64±13.2159.86±13.4856.67±9.0753.56±9.4350.62±12.5063.57±14.2160.25±8.8155.62±12.84A ST/U·L－1 226.7±38.20246.6±32.10233.7±27.64207.1±33.70102.37±15.54148.57±32.41133.37±19.14133.12±18.76A LP/U·L－1 124.40±41.70159.20±39.90147.80±76.50125.50±53.20204.69±67.87184.67±84.20194.75±73.84171.83±67.42G LU/mmo l·L－1 5.35±1.266.11±0.925.36±1.355.44±1.314.61±1.065.19±0.695.21±1.364.57±0.98BU N/mmo l·L－1 9.43±1.2910.59±1.0910.93±1.679.03±1.188.44±1.548.07±1.139.21±1.179.12±1.18組別對照組梗脈通顆粒高劑量組梗脈通顆粒中劑量組梗脈通顆粒低劑量組對照組梗脈通顆粒高劑量組梗脈通顆粒中劑量組梗脈通顆粒低劑量組

表6 梗脈通顆粒對大鼠血液TP、ALB、CHO、Cr、T-Bil的影響（±s）Tab 6Effects of Gengmaitong granules on TP，ALB，CHO，Cr and T-Bil of rats（±s）

表6 梗脈通顆粒對大鼠血液TP、ALB、CHO、Cr、T-Bil的影響（±s）Tab 6Effects of Gengmaitong granules on TP，ALB，CHO，Cr and T-Bil of rats（±s）

時間用藥90d后停藥2周后T P/g·L－1 98.07±11.92106.43±7.54107.26±10.2597.38±4.6983.92±9.5988.42±5.3892.42±11.8686.85±7.19A LB/g·L－1 41.55±4.4842.31±5.1342.15±3.4743.03±3.8038.07±3.3542.01±1.9541.42±3.6338.31±3.61CH O/mmo l·L－1 2.02±0.612.17±0.331.97±0.421.92±0.511.91±0.681.87±0.322.01±0.281.65±0.23Cr/μmo l·L－1 79.93±14.3571.07±10.3770.19±7.9772.94±6.2379.01±10.6286.51±13.4587.37±8.9389.36±17.27T-Bi l/μg·d L－1 5.86±1.517.43±1.458.28±4.616.06±2.351.89±0.732.51±1.052.45±0.952.48±0.98組別對照組梗脈通顆粒高劑量組梗脈通顆粒中劑量組梗脈通顆粒低劑量組對照組梗脈通顆粒高劑量組梗脈通顆粒中劑量組梗脈通顆粒低劑量組

2.2.4 系統(tǒng)解剖與臟器指數(shù)檢查 用藥90d后各組分別解剖12只大鼠，♀♂兼半；其余大鼠于停藥2周后作同樣處理。對各系統(tǒng)組織臟器進行肉眼觀察，以實質(zhì)性臟器重量除以體重得臟器指數(shù)，并進行病理組織學檢查。結(jié)合行為活動、外觀體征的觀察結(jié)果，以自身與組間對比分析，評價該藥物的蓄積性毒性，確定毒性反應(yīng)的靶器官、可逆程度，確定受試藥品有無延遲性毒性反應(yīng)。結(jié)果，用藥90d與停藥2周后，各組♀♂大鼠各組織臟器色澤、形態(tài)、大小、位置關(guān)系均正常，臟器間無粘連，臟器表面及消化管內(nèi)膜均無瘀血、充血、出血點、水腫、潰瘍，胸腔、腹腔、心包腔均無積液等組織病理學改變。各組大鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胸腺、睪丸、附睪（或子宮、卵巢）臟器指數(shù)均在正常值范圍內(nèi)。梗脈通顆粒對雄性、雌性大鼠臟器指數(shù)的影響分別見表7、表8。

表7 梗脈通顆粒對雄性大鼠臟器指數(shù)的影響（±s）Tab 7 Effects of Gengmaitong granules on organ index of male rats（±s）

表7 梗脈通顆粒對雄性大鼠臟器指數(shù)的影響（±s）Tab 7 Effects of Gengmaitong granules on organ index of male rats（±s）

時間 臟器 對照組 梗脈通顆粒高劑量組梗脈通顆粒中劑量組梗脈通顆粒低劑量組用藥90d后心肝脾肺腎腎上腺胸腺睪丸附睪停藥2周后腦心肝脾肺腎腎上腺胸腺睪丸附睪腦0.299±0.0093.131±0.3920.191±0.0270.559±0.1130.536±0.0410.017±0.0020.053±0.0120.767±0.0730.381±0.0390.461±0.0430.29±0.0043.12±0.1580.20±0.0100.68±0.0350.53±0.0410.01±0.0010.08±0.0120.88±0.0450.34±0.0150.44±0.0220.239±0.0053.095±0.2360.168±0.0080.538±0.0610.693±0.0100.017±0.0010.051±0.0040.782±0.0560.386±0.0170.421±0.0210.301±0.0403.116±0.2210.188±0.0130.532±0.0530.695±0.0100.017±0.0010.063±0.0090.826±0.0410.346±0.0090.414±0.0120.315±0.0183.423±0.1640.237±0.0310.586±0.0770.547±0.0510.019±0.0020.064±0.0110.934±0.0610.396±0.0420.474±0.0350.29±0.0033.02±0.1480.19±0.0080.53±0.0430.54±0.0510.01±0.0010.05±0.0070.81±0.0240.32±0.0340.41±0.0120.307±0.0103.215±0.2380.211±0.0210.573±0.0610.505±0.0220.017±0.0020.057±0.0080.845±0.0440.349±0.0170.462±0.0490.317±0.0523.043±0.2790.179±0.0610.658±0.0660.505±0.0220.016±0.0030.103±0.0730.851±0.0520.343±0.0380.425±0.022

表8 梗脈通顆粒對雌性大鼠臟器指數(shù)的影響（±s）Tab 8Effects of Gengmaitong granules on organ index of female rats（±s）

表8 梗脈通顆粒對雌性大鼠臟器指數(shù)的影響（±s）Tab 8Effects of Gengmaitong granules on organ index of female rats（±s）

臟器用藥時間用藥90d后心肝脾肺腎腎上腺胸腺子宮卵巢停藥2周后腦心肝脾肺腎腎上腺胸腺子宮卵巢腦對照組0.35±0.0474.00±0.5210.29±0.0480.61±0.1080.62±0.0700.02±0.0020.09±0.0080.13±0.0130.04±0.0050.56±0.0290.39±0.0443.89±0.1670.28±0.0150.50±0.0310.59±0.0450.02±0.0020.06±0.0090.18±0.0130.04±0.0090.51±0.038梗脈通顆粒高劑量組0.366±0.0064.031±0.2560.290±0.0120.632±0.0490.614±0.0350.022±0.0010.072±0.0100.118±0.0060.040±0.0030.520±0.0250.359±0.0113.753±0.1640.263±0.0270.701±0.0390.606±0.0170.021±0.0010.073±0.0040.103±0.0020.047±0.0060.497±0.033梗脈通顆粒中劑量組0.37±0.0084.06±0.2780.32±0.0340.73±0.0790.63±0.0330.02±0.0020.07±0.0090.12±0.0070.04±0.0060.55±0.0250.37±0.0283.77±0.4250.21±0.0910.69±0.0530.64±0.0850.02±0.0020.07±0.0070.10±0.0220.04±0.0060.51±0.032梗脈通顆粒低劑量組0.348±0.0273.783±0.1910.270±0.0280.713±0.0720.639±0.0430.022±0.0020.077±0.0090.122±0.0080.058±0.0240.426±0.0120.363±0.0233.722±0.2890.236±0.0330.562±0.0480.578±0.0520.021±0.0010.069±0.0130.109±0.0110.047±0.0070.491±0.026

由表7、表8可知，長期連續(xù)ig 35.70、7.14、3.57g·kg－1梗脈通顆粒對♀♂大鼠臟器指數(shù)、臟器外觀形態(tài)無不良反應(yīng)，也無延遲性毒性反應(yīng)。

3 討論

本研究表明，急性毒性實驗給予小鼠本品生藥量120g·kg－1，相當于成人劑量的336倍（本品成人每天服用生藥量25g，25/70＝0.357g·kg－1，120/0.357＝336），用藥后未見急性毒性反應(yīng)。長期毒性實驗給予大鼠本品生藥量35.70、7.140、3.57g·kg－1（分別相當于臨床日劑量的100倍、20倍、10倍），用藥期間除凝血因子外，對大鼠的生長發(fā)育、血液學和血液生化學指標、臟器系數(shù)及組織病理學檢查均未見影響。

給藥90d后，梗脈通顆粒高、中、低劑量組♀♂大鼠TT、PT明顯延長，應(yīng)為梗脈通顆粒中的活血化瘀中藥成分所引起。

本研究提示該藥對實質(zhì)性器官無明顯毒性作用，但其可明顯延長凝血時間，在臨床應(yīng)用中當引起重視。

[1] 孫兆榮，武夏明，劉逢芹，等.正交試驗優(yōu)選酮通顆粒成型工藝[J].中國藥房，2009，20（12）：907.

[2]《中藥、天然藥物急性毒性試驗技術(shù)指導原則》課題研究組.中藥、天然藥物急性毒性試驗技術(shù)指導原則[M].北京：國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評價中心，2005.

[3] 熊 灝，趙 鵬，李 彬，等.藏蟲草膠囊毒理學安全性評價[J].中國藥房，2011，22（15）：1367.