N2a細胞的-80℃凍存與復(fù)蘇

童 飛 許家玉 彭 勇 曹永財

（安徽省蕪湖市無為縣動物疫病預(yù)防與控制中心，無為 238300）

N2a細胞全稱mouse neuroblastoma N2a cells，也有人稱其為Neuro-2a，是小鼠來源神經(jīng)瘤母細胞。目前主要在實驗室培養(yǎng)該細胞系作為體外病理研究的細胞模型。Neuro-2a是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立，該細胞貼壁良好，多數(shù)成神經(jīng)元樣，具有軸突樣結(jié)構(gòu)（圖1）。通常N2a是放到液氮罐中長期保存的，并要定期給液氮罐補充液氮，這樣保存的細胞系，復(fù)蘇后生長狀態(tài)良好，但成本較高，不適合那些充液氮不方便的地區(qū)使用。

圖1 傳代后2 d的N2a細胞

1 N2a細胞的培養(yǎng)

（1）配置高糖的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM，GIBCO)培養(yǎng)基1 000 ml（pH=7.2～7.4）[1，3，4]。 ①1袋DMEM粉劑培養(yǎng)基用去離子水溶解；②加入NaHCO32.0g ；③加入谷氨酰胺0.146 g（終濃度為5 mM）；④加入青霉素10萬U（終濃度100 u/ml），鏈霉素6.5萬U（終濃度100 u/ml）；⑤定容900 ml；⑥過濾除菌、分裝到2個消毒的500 ml藍蓋瓶中；⑦加入滅活10%胎牛血清（fetal bovine serum ，F(xiàn)BS ，GIBCO)100 ml。

（2）轉(zhuǎn)代步驟。 ①棄原培養(yǎng)液用1 mlDMEM洗3遍；②用鈍槍頭吸取0.5ml胰酶（typsin，0.25%）+0.5mlDMEM消化2～3 min，輕搖1 min，鏡下觀察cell脫落、漂浮；③加1mlDMEM+10%fbs終止消化；④用鈍槍頭輕輕吸取培養(yǎng)液吹打，使cell完全散開；⑤將處理好的medium裝入1.5ml的EP管中1000rpm離心，4min棄上清；⑥加0.5mlDMEM+10%fbs重懸cell，混勻cell；⑦取2個30mm的培養(yǎng)皿，各加入2片蓋玻片，將細胞懸液在每片上滴1-2滴，再補全培養(yǎng)液至1/4皿高，轉(zhuǎn)入37℃充滿5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

單層培養(yǎng)細胞在10%FBS-DMEM中能生長很好。一般來講，1∶10傳代后，1周可以長滿。嚴禁過度生長，這點很重要。因為會導(dǎo)致細胞密度加大和堆積，傳代時不易打散。N2a細胞在傳代120次以后，其表型可能改變，生長狀況不再完全是單層的了，偶爾會形成局部的細胞成團聚集，應(yīng)立即拋棄，重新引入新傳代的細胞。

2 N2a細胞的-80℃凍存

正常細胞的凍存是按以下步驟進行。①配置凍存液：DMEM培養(yǎng)液∶FBS∶DMSO＝6∶3∶1( 注意：DMSO稀釋過程中會產(chǎn)熱，故切勿在細胞懸液中直接加入DMSO，可預(yù)先將FBS:DMSO按比例混好，等散熱后，方可加入神經(jīng)球懸液) 。②選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。老培養(yǎng)基吸出放到1.5mlEP管，1∶10(0.25%)胰酶消化2 min； 加入1ml 10% fbs中止消化； 0.5 ml老培養(yǎng)基吹吸細胞，吸入1.5 mlEP管，1000 r離心5min；輕輕倒掉上清，于4℃預(yù)冷15 min后，逐滴加入已無菌的含DMSO的凍存液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻， 按每凍存管約1.2×106凍存，每支1 ml；將裝好細胞的凍存管裝入沙布袋內(nèi)，放入-20℃冰箱放置 2～4 h→放入 -80℃冰箱過夜 →再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2 h，最后沉入液氮中長期保存。

-80℃凍存則將吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2 h和沉入液氮的驟省略，在某些地區(qū)由于經(jīng)濟和位置條件的限制很難及時地買到液氮，因而采用-80℃冰箱凍存細胞的方法顯得格外的靈活適用。通過自己多次的凍存實驗發(fā)現(xiàn)-80℃冰箱凍存細胞在1個月之內(nèi)細胞的死亡率約＜45%，復(fù)蘇后的細胞生長良好；2個月內(nèi)細胞的死亡率約＞80%；3個月后細胞的死亡率為100%（圖2）。所以我們可以采用-80℃冰箱短期反復(fù)地凍存來儲存細胞系，當然此過程操作一定要規(guī)范，減少細胞污染的概率。

圖2 不同時間復(fù)蘇的N2a細胞

3 N2a細胞的-80℃復(fù)蘇

按以下步驟：①帶防凍手套從-80℃冰箱中取出凍存管，快速轉(zhuǎn)入37℃水浴。（通常用保溫瓶事先調(diào)好水溫）10 min左右；②800～1000rpm×5min離心，移去凍存液，（可清洗1次）加入預(yù)溫至37℃的新鮮培養(yǎng)液，適度吹打，種入1個100 mm培養(yǎng)皿；③第2 d分養(yǎng)或傳代。復(fù)蘇接種后24 h內(nèi)，應(yīng)盡量減少觀察細胞次數(shù)或不作觀察，以免因晃動而影響細胞貼壁。復(fù)蘇后48 h左右觀察貼壁情況并進行首次更換培養(yǎng)基比較合適，如果用1次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱。

經(jīng)過多次實驗驗證可知，-80℃冰箱是可以短期凍存（1個月以內(nèi)）N2a細胞系。-80℃冰箱凍存樣品靈活方便、經(jīng)濟實惠、易于操作，尤其是那些比較偏遠的地區(qū)，要克服購買液氮的困難，充分利用-80℃冰箱來保存細胞系和牲畜精液，為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新和基礎(chǔ)性農(nóng)業(yè)實驗研究做出貢獻。

[1]D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.萊茵萬德.細胞實驗指南.北京：科學(xué)出版社，2001.1～188

[2]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南（第三版）. 北京：科學(xué)出版社，2002.1595～1560

[3]Minoru Sakaguchi， Kouichi Murayama， Kozue Yabe，et al.β-Casomorphin-5 stimulates neurite outgrowth in a mouse neuroblastoma cell line (Neuro-2a). Neuroscience Letters，1998. （251）:97-100

[4]Kimberly A. Petro Cara-Lynne Schengrund. Membrane Raft disruption promotes axonogenesis in N2a neuroblastoma cells. Neurochem Res ，2009.34（9）:29-37